鸡传染性法氏囊病的诊断

少林寺

IBD的实验室诊断，取决于病毒的特异性抗体的检测，或组织中病毒的血清学检查，通  常不把病原分离和鉴定作为常规诊断的目的。   

    1．琼脂凝胶沉淀试验  本法是检测血清中特异性抗体或法氏囊组织中病毒抗原的最  常用诊断方法。

    (1)病料采集  采集发病早期的血液样品，3周后再采血样，并分离血清。为了检出法氏囊中的抗原，无菌采取10只鸡左右的法氏囊，用组织搅拌器制成匀浆，以3 000r／min离 心10min，取上清液备用。   

    (2)IBD的标准阳性血清和阴性血清。

    (3)琼脂板制备  取1g优质琼脂溶化于含有0.1％石碳酸的8％氯化钠溶液100ml，经  多层纱布脱脂棉过滤，置冰箱备用。有时放在水溶液化并趁热浇在玻片上，每片4mi，厚约  2．5～3mm。也可以吸15ml倒人90mm平皿内。

    (4)打孔和加样  事先制好打孔的图案(中央1个孔和外周6个孔)，放在琼脂板下面，用批孔器打孔，并剔去孔内琼脂。孔径为6mm，孔距为3mm。检测IBDV的抗体时，中央孔和已知的IBDV的抗原，若测法氏囊中的病毒抗原，中央孔加已知标准阳性血清。现以检    测抗原为例进行加样。中央孔加IBD的阳性血清，1、4孔加入已知抗原，2、3、5、6孔加    入被检抗原，添加孔满为止，将平皿倒置放在湿盒内，置37℃温箱内经24～48h观察结果。

    (5)结果判定  在标准阳性血清与被检的抗原孔之间，有明显沉淀线者判为阳性，相    反，如果不出现沉淀线者判为阴性。标准阳性血清和已知抗原孔之间一定要出现明显沉淀    线者，本试验方可确认。

    2．免疫荧光抗体检查

    (1)荧光抗体  成都兽医生物药品厂生产

    (2)被检材料  采取病死鸡的法氏囊、盲肠扁桃体、肾和脾，用冰冻切片制片后，用丙酮固定10min。

    (3)染色方法  在切片上滴加IBD的荧光抗体，置湿盒内在37℃感作30min后取出，先    用pH7.2PBS液冲洗，继而用蒸馏水冲洗，自然干燥后滴加甘油缓冲液封片(甘油9份，    pH7.2PBSl份)镜检。

    (4)结果判定  镜检时见片上有特异性的荧光细胞时判为阳性，不出现荧光或出现非    特异性荧光则判为阴性。

    (5)注意事项  滴加标记荧光抗体于已知阳性标本上，应呈现明显的特异荧光。滴加    标记荧光抗体于已知阴性标本片上，应不出现特异荧光。本法在感染12h就可在法氏囊和盲肠扁桃体检出。   

    3. 病毒中和试验  可用细胞培养或幼龄鸡进行，他比琼脂凝胶沉淀试验检测抗体更敏    感，对估价疫苗的免疫应答是有用的。

    (1)细胞培养中和试验  在微量滴定板的每孔中，加入0.5ml含100TCID50的病毒稀释液。被检血清经56℃灭能30min，然后以滴定板上的病毒稀释液将被检血清作连续倍比稀释。滴定板在室温放30min后，每孔加入0.2ml制备好的鸡胚细胞悬液，置37℃培养4～5天，每天在倒置显微镜观察细胞病变产生的情况，并以不出现细胞病变的最终稀释度的倒数(log2)判定终点。

    (2)用鸡用中和试验  将被检血清在56℃灭能30min。取lml被检血清与lml已知阳    性IBD抗原(可用细胞培养毒，lml含200TCID50／0.05ml，或用清亮的10％法氏囊匀浆)    合，置37℃孵良30～60min。将上述混合物滴入7只易感鸡眼内(易感鸡不含有IBD抗    体)，每只鸡滴0.5ml，3天后将鸡宰杀，检查其法氏囊有无病变。同时设立IBD阳性血清和阴性血清作对照。若被检血清采于非免疫鸡群，其阳性血清和被检血清鸡的法氏囊无病    变，而阴性血清对照鸡的法氏囊出现病变时，表明被检血清的鸡已感染IBDV；如果被检血    清采于免疫鸡群，出现这种情况，说明IBD疫苗免疫应答较好。相反，阳性血清鸡的法氏    囊无病变，而阴性血清和被检血清鸡的法氏囊出现病变，表明IBD疫苗免疫应答差。

    3．间接ELISA检测IBDV抗体。

    材料准备：

    聚苯乙烯微量反应板、酶标测定仪。

    抗原、兔抗鸡IgG酶标记抗体、阳性血清和阴性血清(自备或购买)。试验溶液配制。

    操作方法：   

    (1)抗原色被  IBDV抗原用0.05mol／LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至5μg／ml，每孔加

  l00μl，置37℃温箱  小时后，再置4℃冰箱过夜。取出后倾去包被液，用PBS—T冲洗液洗涤3次，每次3～5min。加含10％BSA的PBS—T封闭液，每孔加l00μl，置37℃1h，倾去封闭液，同前洗涤。色被好的抗原板用塑料封装，放在一20℃冰箱保存。   

    (2)加被检血清  用血清稀释液按1：400稀释，加入ELISA反应板中，每孔加100μl。

Al孔加稀释液，A2、A3孔加阴性血清，A4、A5孔加阳性血清。阳性和阴性血清不稀释，加  入量同被检血清。然后将反应板放在湿盒中，置37℃1h。

    (3)冲洗  倾去反应板中液体，用冲洗液洗涤3次，每次3～5min。

    (4)加兔抗鸡IgG酶标记抗体  取酶标记抗体lml加00ml酶标稀释液混匀后，再加  100ml灭菌甘油即成10X兔抗鸡IgG酶标记抗体，用安瓿分装每支lml(可放一20℃保存)。用时取出．1支加入9ml稀释液，每孔加入100μl，置37℃1h。

    (5)冲洗  方法同(3)   

    (6)加底物液  将底物液甲液加入乙液中，再加入30％过氧化氢液10μl，混匀后立即  加入反应板上，每孔100μl，37℃避光作用20min。   

    (7)加终止液  每孔加人50μl。

    (8)用酶标测定仪在波长492nm下，测定每孔降解物的吸收值。测定时A1孔调零。

    结果判定：

    被检血清两孔OD值平均值与阴性血清两孔OD值平均值之比，若被检血清OD值≥2者判为阳性。

    试验溶液溶液配制：   

    (1)冲洗液  0.01molpH7.4PBS液配制；  

    取KH2P041g，Na2HP0412H20 14.5g；KCll.0，NaCl42g，无离子水加至250ml溶解。

    (2)酶标抗体和血清稀释掖配制  0.0lmolpH7.4PBS250ml，吐温20 2.5ml，硫柳汞 0.1g。混匀后，按每瓶l0ml分装，室温保存。  

    (3)封闭液配制  取(2)液250ml，BSAlg混匀按每瓶l0ml分装，一20℃保存。

    (4)底物液配制  甲液：取Na2HP04·12H2035.8g，加无离子水1000ml按每瓶6m1分装，室温保存。   

    乙液：取柠檬酸21g，加无离子水1000ml，再加邻苯二胺1.2g，按每瓶3m1分装，一20℃避光保存。

(5)终止液  2mol／L硫酸   

取浓H2S04(纯度95％～98％)4ml加入32ml无离子水中混匀即成。

风雨阳光

鸡传染性法氏囊病是鸡传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触性、免疫抑致性疾病。本病主要侵害鸡的体液免疫中枢器官法氏囊等淋巴组织，因此，该病的危害不仅表现在疫病本身，更重要的是引起鸡体的免疫机能障碍，影响各种疫苗的免疫应答，甚至导致免疫失败。由于免疫抑制，引起继发感染和并发其它疾病，致使死亡率明显升高。
    一、鸡法氏囊病的流行特点
    本病一年四季均可发生，以5～7月为发病高峰。本病主要经水平传播，病毒也可经种蛋垂直传播。近年法氏囊病流行出现死亡率比过去增加，由10%以下增加至13%～50%，高者可达80%;发病日龄提前或推后，目前发病早的有3日龄幼雏，晚的180日龄成年鸡仍发病;病例不典型而且混合感染或者法氏囊病综合症增多;流行多在使用本病弱毒疫苗40～7天后发病。法氏囊病的流行不仅抑制或降低了雏鸡对多种疫苗（尤其是新城疫疫苗）的免疫应答，而且提高了鸡对某些微生物的易感性。由于多年来广泛应用法氏囊病高免卵黄抗体或血清以及法氏囊病疫苗，使得法氏囊病毒长期处于免疫高压下而出现变异型，甚至出现了新的毒株。
    二、临床症状及病理变化
    1.临床症状
    本病潜伏期2～3天，初期症状是部分鸡自啄肛门羽毛，厌食、无神，羽毛松乱、皮肤干燥，排出白色或黄色水样粪便，颈部、躯干部震颤，步态不稳，头下垂，眼睑闭合，脱水，衰弱而死亡，病程5～7天。病愈鸡全身免疫机能降低，易感染其它疾病。
    2。病理变化
    病死鸡尸体脱水，胸、腿肌肉出血，腺胃和肌胃交界处有条状出血点，肾脏苍白肿大，肾小管和输尿管扩张，内有尿酸盐潴留。脾脏轻度肿胀，表面有弥散性的灰色点状坏死灶。法氏囊病变可见法氏囊内粘液增多，法氏囊水肿和出血，体积和重量可增达正常值的2～3倍，浆膜覆盖淡黄色胶样渗出物，囊本身由正常的白色变为奶油黄色。感染的第5天，法氏囊开始缩小，到第8天仅为正常大小的1/3左右，切开后粘膜皱褶多混浊不清，粘膜表面有点状出血或弥漫性出血，严重者法氏囊内有干酪样渗出物。
    三、中草药防治的临床应用研究现状
    应用中草药防治法氏囊病临床使用较多，研究也较深入。根据本病致病的原因是损害肾脏和法氏囊，故首要问题要从缓解肾脏衰弱，化解、排除有形物质，疏通尿路，控制死亡着手。目前对该病防治，多采用清热解毒、泻火燥湿为主的治疗原则，但有向扶正祛邪、清补并用发展的趋势。
    清热解毒用方1：板蓝根、蒲公英、大青叶各50克，双花、黄芩、黄柏、甘草各25克，藿香、生石膏各10克，加水适量煎汤2～3次，过滤取汁，药汁量外来良种肉鸡一般按2毫升/日龄、地方鸡按1毫升/2日龄计算为宜，药汁凉后供100羽鸡一次性内服。投药前鸡群停水3～4小时，严重的病鸡灌服，服药3小时即可见效，次日再服1次能控制死亡。使用本方剂，只要早诊断，病鸡死亡率完全可控制在1%以内。
    用方2：蒲公英、大青叶、板蓝根各200克，双花、黄芩、黄柏、甘草各100克，藿香、石膏各50克，供给 300～500只鸡用，水煎2次，合并滤液3～5千克，令鸡自饮或人工灌服，每只鸡5～10毫升，每日4次，有效率为100%，治愈率为98%。
    用方3：双花20克、黄连20克、黄柏30克、黄芩30克、黄药子20克、白药子20克、党参50克、茯苓20克、甘草30克，按6%～8%拌入饲料中，自由采食。无食欲者煎汤灌服：每只鸡5～10毫升，日服2次。
    用方4：生地4克，双花、公英、丹皮、茅根各3克，此量为10只鸡用，煎汤，令鸡自饮或灌服，连服两剂，治愈率达97%。
    用中草药治疗法氏囊是根据中医基础理论、中药特性、中药的现代抗菌、抗病毒实践而组方。根据中药特性，按中兽医理论分析，法氏囊病属热毒侵袭所致。热为阳邪，易伤阴液，故表现饮欲增加;由于热入血分，迫血妄行，致使肌肉等处出血;又因热邪化火生风，风助火势，上扰神明，故病鸡昏睡，精神不振;热毒耗灼肾阴，故见肾石;热毒易耗津伤血，从而导致本源枯竭，故发病急，死亡快。上述所用中药板兰根、大青叶、金银花具有清热解毒功能，不仅抑菌抗病毒作用强，且抗菌谱广;党参、黄芪补气健脾，增强免疫机能，有益于法氏囊病导致的免疫抑制的改善。板蓝根、大青叶、双花、蒲公英清热解毒，有较强的抗菌抗病毒作用，消除致病之因。黄芩、黄柏清热利湿，藿香芳香化湿，解除法氏囊病的腹泻症状。车前草利尿止泻，既能促进肾脏的尿酸盐排除，消除肾肿，又能止泻。甘草具有补气和中、调和诸药的作用。
    四、鸡法氏囊病的防治机理
    中药除能杀灭、抑制病原微生物外，还能促进免疫器官的发育，促进机体的细胞免疫、体液免疫和细胞因子的产生。其作用机理包括：①通过作用于下丘脑、垂体、肾上腺皮质轴来调节免疫;②通过调节植物神经调节免疫;③通过作用于环核苷酸系统调节免疫;④通过调整核酸代谢调节免疫;⑤通过提高T细胞数量和功能来调节免疫;⑥通过药物和方剂本身的双向调节作用来调节免疫。
    五、中草药防治鸡传染性法氏囊病的前景
    中草药具有资源丰富、价格便宜、毒副作用小的优点，结合季节、气候的影响及鸡在不同生长时期的体质、体况，科学地配伍组方，并辅以严格的饲养管理制度，合理的日粮搭配，清洁卫生的饲养环境，完全可以达到防治鸡病的目的。
    作者单位：五家渠农六师畜牧兽医工作站

九月鹰飞