实验室的建立

土豆

一、细菌培养及药敏试验
1实验器材：显微镜（有油镜），电热恒温培养箱，剪刀、镊子、手术刀、酒精灯、试管架、接种环、羊血平板（可直接购买）、冰箱
2实验药品：各种药敏试纸（壮观霉素、阿米卡星、恩诺沙星、林可霉素、氟哌酸、头孢氨苄、青霉素等，可以直接购买），
香柏油（油镜用）、二甲苯（擦拭油镜用），
革兰氏染色液
3实验步骤
3.1 病料的采集 在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出初步诊断，采取病料所用器械和宣传品器都应事先消毒，确保无毒，采样时应无菌操作.如果动物已死亡，取样应注意以下几点:⑴对急性死亡的动物，从耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片，染色镜检，在排除炭疽后方能剖检取样;⑵采取病料时间，原则是越早越好，夏季要在动物死亡后2小时内采取病料;⑶为了提高病原微生物的阳性分离率，采取的病料要尽量可能齐全，除了内脏，淋巴结和局部病变组织外，还应采取脑组织和骨髓，以防遗漏;⑷认真填写好病料送检单和剖检病理变化记录. 下面介绍病料的采取方法.
3.1.1脓汁 先将表面流水线，然后以灭菌注射器或吸管抽取深部的浓汁;若是开口化脓灶或皮肤，粘膜表面化脓，可用灭菌棉拭子浸沾脓汁后，放入试管中.
3.1.2. 内脏器官 采取心，肺，肝，脾，肾等有病变的组织及其淋巴结，无病变时也要采取，无菌剪取1-2cm大的方块，分别装入灭菌容器内.
3.1.3. 血液 要全血时，无菌采取血液10m，立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或5%柠檬酸钠液1ml的灭菌试管内，并立即混合均匀.要分离血清时，将无菌采取的血液直接注入灭菌试管，待血液自然凝固后分离血清.从尸体采取血液时，可用灭菌注射器或吸管从右心房抽取.
3.1.4. 皮肤和粘膜 采取病变局部的皮肤和粘膜及其所属淋巴结，放入甘油盐水溶液中.
3.1.5. 脑和脊髓 无菌采取脑的脊髓约1-2cm大的方块，放入甘油盐水溶液中.
3.1.6. 胆汁 用灭菌注射器抽出后放入灭菌试管中.
3.1.7. 肠和胃 剪取有病变的部位一段或一块.也可将肠管一段(约6-8cm)用线扎紧两端后剪下送往实验室.
3.1.8. 粪便 可用棉拭子插入肛门沾取，或扑杀病畜后由肠管采取，立即放低温条件下保存.
3.1.9. 乳汁 先用消毒药液洗净乳头及其附近，弃去最初挤出的几滴乳汁，然后采取乳汁约10ml放入灭菌试管内.
3.1.10. 流产胎儿 可将整个胎儿用塑料薄膜包紧，装入箱中送检.
3.2细菌的分离与接种 培养细菌时，须将标本或细菌培养物接种于培养基上，
平板划线接种法 本法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃培养箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。
组织可以用镊子夹住，放在酒精灯上灼烧片刻，杀死表面的细菌，然后用灭菌的剪刀从一端依次剪下，在酒精灯旁将组织新截面涂擦在培养基上，37℃培养箱内培养12小时。
3.3细菌的培养方法 根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法，二氧化碳培养法和厌氧培养法三种
3.3.1. 一般培养法 将已接种过的培养基，置37℃培养箱内18-24小时，需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3-7天直至一个月才能生长。为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固，以防培养基干裂。
3.3.2. 二氧化碳培养法 某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10%二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格.将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法，常用方法有以下几种:
(1) 二氧化碳培养箱 可将已接种的培养基直接放入箱内孵育，即可获得二氧化碳环境。
(2) 烛缸法 将已接种的培养基，置于容量为2 000ml的磨口标本缸或干燥器内.缸盖或缸口处均需涂以凡士林，然后点燃蜡烛直立置入缸中，密封缸盖.待燃自行熄灭时，容器内约含5-10%的CO2 容器置37℃培养。
(3) 重碳酸钠-盐酸法 每升容积的容器内，重碳酸钠与盐酸按0.4g与3.5ml的比例，分别将两种药各置一器皿内(如平皿内)，连同器皿置于标本缸或干燥器内，盖严后使容器倾斜，两种药品接触后即可产生二氧化碳.
3.3.3. 厌氧培养法
厌氧培养箱 使用之前须仔细检查厌氧装备有无漏气等问题，以及催化剂，指示剂质量等。使用时严格遵守操作规程，保证箱内气体比例合理。
3.4 药敏试验
在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密），将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。
将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。
3.5 革兰氏染色法 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
　　１）涂片固定。
　　２）草酸铵结晶紫染1分钟。
　　３）自来水冲洗。
　　４）加碘液覆盖涂面染1分钟。
　　５）水洗，用吸水纸吸去水分。
　　６）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。
　　７）沙黄（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
[注意事项]：
1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
2．玻片通过火焰温度不能太高。
3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。


二、抗原（病毒）检测

项目    方法    样品要求    成本费    备注
猪瘟    进口ELISA    脾肾肺全血死胎    1次230元    可检测6份
牛粘膜病毒    进口ELISA    脾肾粪便死胎    1次230元    可检测6份
圆环病毒    PCR    肺淋巴粪便死胎    1次300元    可检测6份
伪狂犬病毒    PCR    肺淋巴脑死胎全血    1次300元    可检测6份
蓝耳病毒    PCR    肺淋巴死胎血清    1次300元    可检测6份
乙脑病毒    PCR    死胎全血    1次300元    可检测6份
呼吸道冠状V    PCR    鼻拭子肺淋巴    1次300元    可检测6份
流行性腹泻V    进口ELISA    粪便或小肠    1份50元   
传染性胃肠炎V    进口ELISA    粪便或小肠    1份50元   
轮状病毒    进口ELISA    粪便或小肠    1份50元   
细菌分离    需氧\厌氧    脾鼻拭子肺淋巴    1份50元    包括药敏
病毒分离    细胞培养    脾鼻拭子肺淋巴    1份200元    时间一周


抗原检测主要有ELISA和PCR两种方法，现分别介绍如下：
因为ELISA法是一种采用试剂盒程序式的操作，每一种检测方法操作步骤在说明书上都有写明，只要按操作步骤依次滴加试剂就可以，以猪瘟抗原检测方法（ELISA）为例说明。

猪瘟抗原检测方法（ELISA）
所需要的仪器：ELISA仪、恒温培养箱、200-1000ml移液器、20-200μl移液器、水浴锅。
步骤程序：
A：试剂的准备：
1、将所有试剂均放至所需孵育温度。
2、确定用于洗涤微量滴定板所需的CHEKIT-洗涤稀释液的量。用水将10倍洗涤浓缩液做1：10稀释（1份洗涤浓缩液加9份水，即100ml10倍洗涤浓缩液加900ml蒸馏水）。在无菌条件下制备的这种溶液，在4-8℃下保存时，可以使用7天。
3、组织样品制备：
用剪刀或锋利的刀子将组织块制成匀浆，用PBS（一种缓冲液，可自己配制）做1：10稀释。对这种溶液的测定方法与血清样品的测定方法相同。
B：样品和对照品的稀释、加样和孵育
1、HEKIT-HCV-抗原-样品-稀释液，每孔中加入50μl。
2、宜的孔中加入未经稀释的样品和对照品各150μl。样品和对照品的最终稀释度为3：4。
3、振动微量滴度板，使每个孔中的内容物混合均匀（可以使用微量滴度板振荡器）。
4、子将微量滴度板盖上，在37℃（±2℃）的湿盒中孵育60分钟（±5分钟）。孵育温度较低时，孵育时间就较长（如在2-8℃下孵育时，需要湿盒过夜（14-18）小时。
C：微量滴定板的洗涤
   孵育结束后，按照下列方法对微量滴定板进行洗涤。充分甩去各孔中的液体，然后向每个孔中加入至少加入300μl CHEKIT洗涤液，避免产生气泡。共洗涤3－5次。充分甩去各孔中的液体，然后在吸水纸上使劲拍干。在向孔中加入下一种溶液前，不要将拍干的滴定板在试验台上长时间防治。
   注意：如果对微量滴定板洗涤不够，将会使背景值提高。
D：CHECKIT-HCV－抗原－抗Er ns－酶标抗体的加入和孵育
1、    每孔中加入酶标抗体各100μl。
2、    加盖后，将微量滴定板放在37℃（±2℃）的湿盒中孵育60分钟（±5分钟）。
E：微量板的洗涤：按照C项进行，但只洗涤3次
F：加入CHECKIT-TMB－底物
   将TMB第五预温至25℃，项每孔中加入100μl。在室温（18℃－25℃）下孵育。如果样品的孵育时间较短，则此时最好在25℃下孵育15分钟（±5分钟）；如果样品湿孵育过夜的，则此时最好在25下孵育10分钟（±3分钟）。
   注意：在我们的实验室中进行验证试验时，所需的底物孵育时间如上。但是，所需的反应时间可能受到多种因素的轻微影响，入洗涤过程的质量、加样的准确性、孵育步骤的温度、底物的温度等。因此，用户在进行试验时的实际反应终止时间可以在推荐的时间的基础上提前和推迟几分钟。见Bommeli诊断试剂内部质量检验。
G：读取结果
将CHECKIT－终止－TMB－溶液预温至室温（18－25℃），向每孔中100μl以便终止颜色反应。终止液的加入顺序和速度应与底物的加入顺序和速度相同。
   读取450nm波长处结果。
   阳性对照的OD值应不大于2.0，阴性对照的OD只应低于0.5，阳性对照和阴性对照的差异应至少为0.3，试验方有效。
   加入终止液后，应确保在2小时内进行读数。
H：结果判定
   对2个孔的OD值取平均值。通过减去阴性对照的OD值（OD阴性），对阳性对照孔的OD值（OD阳性）进行校正：
   阳性对照：OD阳性－OD阴性
   样品：OD样品－OD阴性
   根据下列公式分析样品与阴性对照和阳性对照之间的关系：
   值（％）＝（OD样品－OD阴性）/（OD阳性－OD阴性）×100％
值    <30％    30％－40％    >40％
判定    阴性    可疑    阳性
   如在第二轮试验中，样品仍然为可以，应从同一动物采集新的样品进行重新检测。如果新的样品检测结果仍然为可疑，应对流行病学状况进行考虑。如果可能，可采用不同方法对样品重新进行检测。
注意事项
   该试剂盒仅用于体外检测。
   异常的样品：应将明显异常的样品排除出去（如：含有或出现浑浊、絮片、细菌污染的样品）、
   对照：每块微量滴定板上均应设立阳性和阴性对照。
   串孔：为了避免抗原从一个孔中串到另一孔中，每个样品均应使用不同的吸头和吸管。
   泡沫的形成：必须小心加样，以避免形成泡沫。
   试剂稀释后的稳定性：样品和对照品必须在使用前进行稀释。一旦稀释后，是不稳定的。在无菌条件下制备的洗涤稀释液在4－8℃下保存时，可以在1周内使用。
   污染：无论是由使用过的容器、加样器具、洗涤设备还是由水引起的污染，即使是最轻度的污染，也可能改变酶标抗体或底物的效果和特性。所有试剂均需用一次性塑料吸头吸取。
   仪器和设备内的污染导致结果出现误差，这是经常出现的现象。如果有所怀疑，用手工方法进行平行测定，并对结果进行对比。
吸收纸偏低：如果吸收值偏低，建议对用于制备洗涤稀释液的水的质量进行检查。
另外，核实使用前的TMB底物是否在18－25℃，或是否为最适温度25℃。
配对值不一致、结果异常或背景值偏高
配对值不一致、结果异常或背景值偏高的原因多在于：
－底物混合不均匀。微量滴定板振动不充分时会出现这种现象。
－试管、瓣膜、喷嘴或洗涤设备污染了化学物质或微生物。
－加样误差。
检测方法总结
  在第一次进行该检查前，强烈建议认真阅读全部说明书。
1    试剂准备    将所有试剂在使用前均放至各自的孵育温度。
用水将10倍洗涤浓缩液做1：10稀释，制备CHEKIT洗涤稀释工作液。
2    样品稀释    取CHEKIT-HCV-抗原-样品-稀释液，每孔中加入50μl。
在适宜的孔中加入未经稀释的样品和对照品各150μl。样品和对照品的最终稀释度为3：4。
轻轻振动微量滴度板，使每个孔中的内容物混合均匀（可以使用微量滴度板振荡器）。
3    样品孵育    在37℃（±2℃）的湿盒中孵育60分钟（±5分钟）。孵育温度较低时，孵育时间就较长如在2-8℃下孵育时，需要湿盒过夜（14-18）小时。
4    洗板    3－5×300μl CHEKIT洗涤稀释液
5    加酶标抗体    取HECKIT-HCV－抗原－抗Er ns－酶标抗体，每孔加入100μl。
6    酶标抗体反应    加盖后，将微量滴定板放在37℃（±2℃）的湿盒中孵育60分钟（±5分钟）。
7    洗板    3×300μl CHEKIT洗涤稀释液
8    加入底物    每孔加入100μl
9    底物反应    在25℃下孵育15分钟（±5分钟）；如果样品湿孵育过夜的，则此时最好在25下孵育10分钟（±3分钟）。
10    终止反应    每孔加入100μl
11    判定结果    <30％    30％－40％    >40％
        阴性    可疑    阳性


                        抗原检测（PCR法）
所需要的仪器：PCR仪、高速低温离心机（１５０００g／min）、恒温培养箱、电泳仪、200-1000ml移液器、20-200μl移液器、0.5-10μl移液器、水浴锅、低速离心机。
步骤程序：因为病毒有DNA、RNA病毒两种之分，操作方法不一样。
DNA病毒操作步骤为：病料中总DNA的抽提：取病猪脑用研磨器充分研磨，用Hanks液1∶5稀释，反复冻融3次以上，7000 r/min离心10 min，取上清500 μl，加30 μl 10% SDS和10 μl 20 mg/ml蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2 h。加入等量的饱和酚，12000 r/min离心5 min。取上清液，加入等量的酚∶氯仿（1∶1），旋涡振荡20 s，12000 r/min离心5min。取上清液，加入等量的氯仿，振荡混匀，12000 r/min离心5 min。取上清液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2)，使其混匀。-20℃放置30～120 min，12000 r/min离心10 min，弃上清，用75%无水乙醇冲洗2次沉淀，晾干，加入25 μl无Rnase的水溶解即为模板。PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)?2.0 μl，MgCl2(25 mmol/L) 2.0 μl，PR1和PR2(25 pmol/μl)各0.5 μl，cDNA 3.0 μl，0.25 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl)，加H2O至25 μl。预变性94℃ 3min进入循环，94℃1 min，65℃1 min， 72℃1 min，30个循环后72℃延伸5 min。电泳观察结果：反应结束后取5μl PCR产物在1.5%～2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察到217 bp的目的片段。
RNA病毒操作步骤为：病料中总RNA的抽提：取约1 g组织块于研磨器充分研磨，用Hanks液1∶5稀释，反复冻融3次以上，8000 r/min离心10 min，取上清液300μl，加入500 μl的Trizol，反复颠倒几次混匀后，室温下放置5 min。加入160 μl氯仿，旋涡振荡15 s混匀，室温下放置2～3 min，12000 r/min离心10 min。取上清转移到新的EP管，再加入500 μl异丙醇混匀，室温下放置10 min。12000 r/min离心10 min，弃上清液，再加入75％酒精1000 μl，旋涡振荡混匀，12000 r/min离心5 min。弃去上清液，37℃晾干EP管中的RNA后，用无Rnase的水35 μl溶解，-70℃冻存备用或即用。cDNA合成及目的基因片段扩增：取16 μl RNA与1 μl的反向引物混匀，于PC仪中70℃ 5 min，90℃ 5 min后，立即放入冰箱-20℃ 5 min。在上液中加入如下试剂：5 μl5×RT buffer，4 μl dNTPs（2.5 mmol/L），RNasin 0.5 μl， M?MLV反转录酶0.5μl。混匀后置PCR仪中42℃反转录1 h 后于-20℃保存备用。PCR反应体系：10×PCR buffer 5.0 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 4.0 μl，MgCl?2(25 mmol/L)4.0 μl，P1和P2(25 pmol/μl)各1.0 μl，cDNA 4.0 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl，加H?2O至50 μl。PCR反应参数：95℃预变性3 min，95℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃再延伸10 min。电泳观察结果：反应结束后取5 μl PCR产物在1.5%～2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察扩增的目的片段。


现在存在的主要问题是DNA、ＲＮＡ的扩增时需要的引物因病毒不同而不同，也是PCR的关键，我们拥有引物序列后可以去生物公司合成，但是我和他们的试验人员沟通时，他们也不知道引物的序列，这个还需要与魏老师沟通，看能不能要出来。
     他们在细菌培养时，只是应用羊血平板，而且只是在有氧条件下培养，没有将厌氧考虑进去。培养结束后，包括病毒检测结束后，没有消毒就直接倒入了垃圾箱，可能会污染环境。

三、抗体检测
项目    方法    样品要求    成本费    备注
兰耳    进口ELISA    90-100日龄仔猪血，早产母猪血、免疫后3周血    1次40元   
伪狂犬免疫抗体    进口ELISA    免疫后3周血    15    可以区分疫苗野毒抗体
伪狂犬野毒抗体    进口ELISA    90-100日龄仔猪血，流产母猪血    20   
猪流感H1抗体    国产HI    90-100日龄仔猪血，发病初期和康复期血    10   
猪流感H3抗体    国产HI    90-100日龄仔猪血，发病初期和康复期血    10   
胸膜肺炎放线杆菌    进口ELISA    90-100日龄仔猪血，发病初期和康复期血    30   
乙脑    国产IHA    死产胎母猪血、免疫后3周血    5   
细小病毒    国产IHA    死产胎母猪血、免疫后3周血    5   
猪瘟    国产ELISA    免疫后3周血    5   
衣原体    国产IHA    发病初期与康复期血    5   
弓形体    国产IHA    发病初期与康复期血    5   
口蹄疫    国产IHA    免疫后3周血    5   

四、尿液的检查