动物性食品中氟喹诺酮类兽药残留检测技术研究进展

猪年

穆国冬[sup]1[/sup]，谭建华[sup]2* [/sup]

(1.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 130062；2.军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130062)  

摘　要：氟喹诺酮类兽药是近年发展起来的一类广谱抗菌药，随着该类药物使用量的增多和人们对食品安全的关注，兽药残留问题越来越被人们所重视。用于氟喹诺酮类兽药残留检测的方法主要有微生物法、免疫分析法、液相色谱法、高效液相色谱法等。目前主要的检测方法是高效液相色谱法，但该方法样品前处理比较繁琐，不适合大量样品的快速检测；微生物法是一种抗菌药物残留检测的快速筛选方法，但该法的检测限量高于欧盟所规定的最低检测限量；免疫分析技术是以抗原抗体的结合反应为基础的分析技术，其特点是特异性强，简单、灵敏、快捷，可用于大量样品的快速检测。
关键词：氟喹诺酮；残留；检测；动物性食品
随着人民生活水平的不断提高，人们开始越来越关注食品安全问题。尤其是动物性食品，兽药残留是一个不能回避的问题。近年来氟喹诺酮类药物使用较多，所以该类药物的兽药残留问题比较严重。
喹诺酮类药物是最近20年来迅速发展起来的继磺胺类药物之后人类在合成抗菌药方面最重要的突破。喹诺酮类药物为细菌DNA合成抑制剂，作用的靶酶是DNA旋转酶，又称拓扑异构酶Ⅱ，是由两个A、B亚单位组成的四聚体，主要催化染色体或质粒发生拓扑学转变。该类药物的发展经历了以下几个阶段：1962年美国科学家发现了第一个喹诺酮抗菌药——奈啶酸，此后又出现了奥啉酸、吡咯酸，称为第1代喹诺酮类药物。由于抗菌谱窄，半衰期短，毒副作用和细菌抗药性等问题，现已很少用。20世纪70年代开发出吡哌酸、氟喹酸等第2代喹诺酮类药物。20世纪80年代出现了抗菌谱更广、抗菌作用更强的第3代喹诺酮类药物。其C-6位上有氟原子，C-7位上连接哌嗪基，亦称为6-氟喹诺酮或氟喹诺酮。发展至今，氟喹诺酮类已发展到第4代[sup][1][/sup]。
1　氟喹诺酮类药物残留检测现状
随着氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQs)在食品动物中的广泛应用，其残留问题已引起广泛的关注。FQs残留除了其毒副作用对人类的直接危害外，更为严重的是动物性食品中残留较低浓度的药物容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而不利于该类药物对人类疾病的治疗，因此必须十分重视FQs在动物性食品中的残留问题。
为了监控FQs在动物性食品中的残留，联合国粮农组织(food and agriculture organization，FAO)/世界卫生组织(world health organization，WHO)和食品添加剂联合专家委员会(expert committee on food additives，JCEFA)制定了单诺沙星在牛、猪、禽的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)。欧盟在1999年3月4日公布了5081999号法规，对4种FQs(单诺沙星、二氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星)MRL作了规定。
兽药残留的检测主要分两个部分，即样品前处理和检测。一般来讲，样品前处理比较麻烦费时，要占整个检测的大约70%左右的分析工作量。样品前处理一般分为提取、净化、浓缩和衍生化4个部分。  
动物性样品的分离纯化是兽药残留分析技术中的重点和难点，也是当前研究的热点。其难点在于样品基质复杂，干扰物质多，而且残留物浓度很低，因而不易从样品中分离、纯化。因此，研究和发展一些新的样品分离纯化技术已成为兽药残留分析领域中的关键技术之一。
当前比较常用的样品的分离纯化技术主要有免疫亲和色谱技术，分子印迹技术，基质固相分散萃取技术，超临界流体萃取技术和固相萃取技术等[sup][2-5][/sup]。
1.1　免疫亲和层析技术
免疫亲和层析技术(immunoaffinity chromatograp hy，IAC)是用色谱柱技术，把抗体固定在适当的支持物上，制备出用于药物残留检测的样品分离纯化IAC柱。利用抗体与抗原或半抗原可逆的生物专一性相互作用来净化和富集分析物。其特点是具有高度的选择性和特异性，特别适用于复杂样品基质中痕量组分的分离。该技术的关键是选择合适的支持物、抗体和淋洗缓冲液。IAC的发展方向是使生物样品中多个药物同时得到高效分离纯化。将IAC作为理化测定技术的样本净化手段，避免了免疫分析直接测定样本的诸多不足，IAC的高选择性和高效性无疑使样本前处理大大简化，通常一次层析即可使待测物得到高度净化和富集，并提供了待测物的定性信息；使用多种抗体制备的IAC柱使免疫分析实际具备了处理多残留组分的能力。这种联用技术无论在理论上还是实践上都是相当完善的分析方法，如组织中氯霉素、阿维菌素/伊维菌素的测定。多种抗体制备的IAC柱是兽药残留免疫净化方法的重要发展方向。
1.2　分子印迹技术
分子印迹的原理是首先使拟被印迹的分子与聚合物单体键合，键合方式有共价结合或非共价结合两种。然后将聚合物单体交联，再将印迹分子从聚合物中提取出来，聚合物内部就留下了被印迹分子的印迹。分子印迹技术可以用于药物、激素、蛋白质、兽药、氨基酸、多肽、碳水化合物、辅酶、核酸碱基、甾醇、染料、金属离子等各种化合物分离工作。除分离作用外，此项技术还可用于制备人工抗体和受体，生物传感器类似物等。分子印迹技术在残留分析领域的研究刚刚起步，是一个新的发展方向。彭涛(2002)首次利用该技术检测了玉米赤霉醇残留，检测限可达10 μg。
1.3　基质固相分散萃取技术
基质固相分散萃取技术的原理是将涂渍有C[sub]18[/sub]等各种聚合物单体的固相萃取材料与动物组织样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测药物洗脱。其特点是处理样品速度快，溶剂用量少。
1.4　超临界流体萃取
超临界流体是指当物质的存在温度和压力超过其临界温度和临界压力时，该物质通常处于超临界流体状态，超临界流体具有特殊的热力学和流体动力学性质，当用作流动相时，具有较高的分离效率，适用于分析热不稳定和高分子量化合物。该技术具有选择性好、前处理简单、分离时间短、完全避免有毒有机溶剂的使用等优点。其缺点是实验条件的选择和优化比较困难，萃取体系的可选择性差，仪器价格昂贵。
1.5　固相萃取法
固相萃取法(solid-phase extraction，SPE)是常用的净化方法，又称固相分离(solid-phase isolation，SPI)。SPE常指一次性使用的可弃小柱，其填料一般专门为样品处理设计，固定相量相对较少，节省时间和溶剂，易于自动化。其基本用途是净化和富集，还包括组分分组，溶剂转换，样品脱盐，不稳定和挥发性样品的贮存和原位衍生化。Posyniak A(2003)利用SPE技术检测牛肝脏中克仑特罗残留，Codony R(2002)检测家禽肌肉中大环内酯类药物残留，Cinauina A L(2003)检测羊奶中FQs残留。事实上，该技术贯穿于当前的大部分的残留检测方法中。
另外，用于兽药残留分离纯化的技术还有固相微量萃取法、凝胶渗透色谱、吹扫-捕集、膜分离技术、超声波辅助萃取、磺化萃取、样品消解萃取等。
2　氟喹诺酮类药物残留的主要检测方法
目前用于氟喹诺酮类兽药残留的检测方法主要有微生物法、免疫分析法、液相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等[sup][6-9][/sup]。
2.1　微生物法
微生物法是一种抗菌药物残留检测的快速筛选方法。Okerman L等(1998)报道了用改进的欧洲四平皿法(four-plate test，FPT)检测市场上零售肉中恩诺沙星和环丙沙星的残留[sup][10][/sup]，四平皿法虽能检测高浓度氟FQs的残留，但该法的检测限高于欧盟所规定的MRL。
2.2　液相色谱法
反向液相色谱法(liquid chroma tography，LC)操作简单，方法灵活，使用水溶液作流动相，是前些年用来检测FQs残留常用的方法。Jefferry R M等(1994)报道了用LC法测定沙拉沙星在海峡鲇鱼中的残留[sup][11][/sup]。Roybal J E(1997)报道了牛奶中沙拉沙星、双氟沙星、思诺沙星的LC检测法[sup][12][/sup]。但由于FQs结构中的叔胺基和羧基团能在水中发生解离，固定相表面的这些活性位点可通过氢键或离子交换作用强烈吸附FQs，出现色谱峰拖尾，保留值不稳定或过长，甚至被长期保留在色谱柱上，导致峰形异常和分离度下降，这些都影响了FQs检测的准确性。
2.3　高效液相色谱法
高效液相色谱法(high-performance liquid chroma tography，HPLC) 是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，具有气相层析的全部优点，分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极广。
邱银生等[sup][13][/sup]报道了盐酸沙拉沙星在肉鸡组织中残留的HPLC检测法。样品制备：组织样品用乙腈-氨水匀浆，离心后取上清液用正己烷-乙醚除脂，水相磷酸化后作HPLC检测。色谱条件：HypersilC[sub]18[/sub]柱，流动相为乙腈-2%四丁基溴化铵(体积比10∶90)，用磷酸调pH至2.5，流速1.5 mL/min。紫外检测器，波长为280 nm。肝脏、肾脏、肌肉中沙拉沙星的检测限为0.05 μg/g，组织样品回收率均大于90%。
丁焕中等[sup][14][/sup]报道了血浆中沙拉沙星浓度测定的HPLC法，血浆样品经甲醇沉淀血浆蛋白，高速离心，取上清液作HPLC检测。色谱条件：Nova-pakC不锈钢色谱柱，流动相为乙腈-四丁基溴化铵溶液，流速1.0 mL/min，荧光检测器：激发波长278 nm，发射波长460 nm。此外，董琳琳等[sup][15][/sup]还报道了用反相高效液相色谱法同时测定4种FQs在鸡可食性组织中的残留。  
此外，诺氟沙星、单诺沙星、恩诺沙星、环丙沙星残留检测的HPLC法也都有报道。但HPLC法检测时，每个样品都先要用不同的有机溶剂提取，然后用各种溶剂除去样品中的蛋白质及脂肪等杂质，最后上机检测。总的说来，HPLC法(含LC法)灵敏度高，检测限大多为10 μg，方法稳定，精确度高(回收率大于70%)，特异性强，适于作确证性检测。缺点是样品的前处理较繁琐。
2.4　高效薄层色谱法
高效薄层色谱法(high performance thin layer chromatography，HPTLC) 的出现使薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)进入了新的时期，现已成为仅次于HPLC和GC的残留分析方法。HPTLC的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料(53 μm～10 μm)改变了常规TLC在灵敏度和重现性方面的不足，但保持了TLC的简便、快速和样品容量大的优点，可使用正相或反相板，分辨率几乎与HPLC相当。HPTLC在兽药残留的快速筛选性检测方面应用广泛。Vega M等[sup][16][/sup]报道了测定鱼饲料和组织中噁喹酸、氟甲喹的HPTLC。
2.5　液相色谱-质谱联用法
液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrography，LC-MS)的灵敏度高，能方便地对微量兽药残留组分进行检测，同时能对兽药残留组分进行结构确证，因而极可能成为FQs多组分残留确证检测的最佳方法之一。Toussaint G等[sup][17][/sup]建立了猪肾脏中11种FQs残留的LC-MS分析方法。LC-MS具有很好的选择性和灵敏度，样品处理方法简单。目前，几乎所有重要的FQs已建立了LC-MS分析法。
2.6　高效毛细管电泳法
高效毛细管电泳法(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)是近年来发展起来的一项新技术，具有操作简单、色谱柱不受样品污染、分析速度快、分离效率高、样品用量少、运行成本低等优点，有利于实际样品的分析。朱斌等[sup][18][/sup]报道了加替沙星含量测定的HPCE法。
2.7　表面等离子谐振
表面等离子谐振(surface plasmon resonance，SPR)免疫生物传感器检测动物性食品中兽药残留的原理与残留检测中常用的酶联免疫法或放射免疫法的原理基本一致，都是基于抗原抗体反应，但对反应的检测方式不同。在传感器分析中，抗原抗体反应发生在传感器的核心部件传感器芯片上，因此这种检测技术也是一种生物芯片技术[sup][19][/sup]。
20世纪90年代，瑞典的BiacoreAB公司及其产品将SPR免疫生物传感器技术引入动物组织的兽药残留分析中，显示了独特的优越性。该公司及瑞典、英国、德国的几个实验室所进行的研究涉及磺胺、克仑特罗、恩诺沙星、氯霉素等药物在牛奶、尿液、胆汁或组织中的残留分析。由于这种传感器具有毋须标记，可直接检测待检物的浓度，简化甚至不需样品的预处理和纯化程序，实时在线监测分子间反应的优点，因而大大缩短了检测时间，有可能使兽药残留检测中筛选样品的数量大幅度增加。1998年6月欧盟启动了FoodSENSE研究项目，目的是检验SPR免疫生物传感器在食品中兽药残留筛选检测方面的可应用性，已于2000年底完成，取得了实验数据，并成立了新的公司生产配套试剂盒。至2002年11月，已有6种试剂盒投入应用，可分别快速检测食品中磺胺(磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶)、克仑特罗、链霉素、氯霉素和莱克多巴胺残留。2002年欧盟专家对未来食品质量和安全方面的研究项目进行了广泛评议，SPR免疫生物传感器检测兽药残留的研究被列入到欧盟基金支持的候选项目名单，称为BioCop，将进行下一步的研究。
2.8　免疫分析法
免疫分析法(immunoassays，IAS是以抗原抗体的结合反应为基础的分析技术。其特点是特异性高，简单、灵敏、快捷，其中核心试剂是抗体。目前应用于国内兽药残留检测中的方法主要有免疫学方法、微生物方法和理化分析方法。三类方法中免疫学方法灵敏度最高，除质谱方法外，特异性最好仍为免疫学方法。免疫学方法主要有ELISA方法，胶体金试纸条和蛋白质芯片，流动注射免疫分析，荧光免疫测定法和免疫传感器等方法[sup][20][/sup]。这几种方法中ELISA方法灵敏度和特异性最高，单个检测成本最低。ELISA试剂盒为定量方法，灵敏度可达纳克级，如氯霉素试剂盒可达50 ng，操作相对简单，样本处理后一次可进行上千个样本的检测，可实行单个药物检测或多残留检测。试纸条方法为定性方法，其特点为操作简单，样本处理后检测时间短，但灵敏度比ELISA试剂盒低5倍～10倍，特异性差，仅适合残留限量要求不高的少数药物的粗筛。蛋白质芯片的优势为多残留检测，但灵敏度需进一步提高[sup][21][/sup]。
2.8.1　酶免疫测定法(enzyme immunoassay EIA) EIA始于20世纪70年代，使用酶进行标记。在分析中较为常用的是酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，一般将抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应，经底物显色后用酶标仪进行检测。ELISA作为残留检测快速的筛选方法，已广泛应用。兽药的分子质量都小于5 ku，是半抗原，不能刺激动物机体产生免疫应答，需与大分子物质如牛血清蛋白、人血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白等联接，作为免疫原。其中半抗原的结构改造是抗体制备的关键和难点。利用化学知识将半抗原进行结构改造，可制备用途不同的抗体，即针对单一药物的高特异性抗体或针对某一类药物的抗体。目前的主流研究方向是单克隆抗体(monoclonal antibody，McAB)的制备[sup][22][/sup]。Holtzapple C K等(1997)报道了抗沙拉沙星的单克隆抗体的制备方法及用竞争性酶联免疫法检测组织中FQs残留的方法[sup][23][/sup]。将沙拉沙星与牛血清白蛋白结合成完全抗原，然后免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出能分泌抗沙拉沙星的抗体并克隆，用竞争性酶联免疫法检测单克隆抗体的效价及组织中FQs的含量。向组织中添加10、50、100 μg的沙拉沙星后，其平均回收率分别为132%、78%和81%，变异系数为9%，检测限为2 μg。但Holtzap-ple等所制备的抗沙拉沙星的单抗与沙拉沙星、双氟沙星、曲氟沙星有同样的亲合力，与诺氟沙星和萘啶酸也有一定的亲合力。故本法不适合作残留确证，而适于快速筛选。
2.8.2　荧光免疫测定法(fluorescent immunoassay FIA)[sup][23][/sup] FIA使用荧光物质或潜荧光物质作为标记物，分为底物标记荧光免疫测定法、荧光偏振免疫测定法、荧光萃取增强免疫测定法和时间分辨荧光免疫测定法。FIA具有极高的灵敏度，适合应用于兽药残留分析。
荧光偏振免疫测定法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)是采用均相分析方式，常用的荧光标记物为荧光素的各种衍生物，如异硫氰酸荧光素等。与ELISA相比，均相FPIA不需要其他的分离和反应步骤，成本低操作方便，易于自动化，影响方法灵敏度和特异性的因素较少，适用于大批量样本中兽药残留快速筛选性检测，既可用于实验室，亦可用于现场检测。
时间分辨荧光免疫测定法(time-resolved fluoroimmunoassay TrFIA)。是利用长寿命的荧光物质进行标记，当寿命较短的生物材料背景荧光完全衰减后再进行检测以消除本底的干扰。通常采用镧系元素作标记物。
2.8.3　胶体金免疫测定法(colloidal gold immune technique CGIA) CGIA是一种利用胶体金颗粒作为标记物的一项新技术。抗原或抗体能够吸附胶体金颗粒表面形成一个蛋白质层，形成稳定的蛋白质溶液。以条状纤维层析材料为固相(通称试纸条)，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截流在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验现象(如显色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。Legg(2003)应用该技术检测了牛奶中的磺胺二甲嘧啶和四环素残留。
2.8.4　流动注射免疫分析(flow injection immunoassay，FIIA) FIIA属于非平衡态分析方式，能进行均相或非均相测定。FIIA测定时间较少，方便自动化，FIIA可以看作是流动注射分析与免疫分析的联用技术。在免疫分析自动化和实时分析方面有良好发展前景。Meyer(1999)应用该技术检测牛奶中的头孢菌素残留。
2.8.5　免疫传感器　免疫传感器是生物传感器的一种，传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别反应，产生一些物理化学信号(如光、热、声、质量、颜色、电化学等)的变化，这些变化通过不同原理的传感器(如光敏感、压电装置，光极、热敏电阻、离子选择性电极等)转换成第二信号(常为电信号)，经放大后显示或记录。利用兽药与特异性抗体结合反应特性研制出的免疫传感器，可用于对相应兽药残留进行快速定量定性检测。其最大特点是便携性，免疫传感器高度的自动化、微型化与集成化减少了对使用者及环境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外进行快速筛选检测。
3　结语
总之，我国对该类药物的残留研究仍处于初级阶段，还需研究我国畜禽常用药的多残留检测方法和ELISA检测试剂盒。另外，对动物组织中药物残留的检测除了检测原形药物外，也不能忽视其代谢产物的检测。