[分享]【家禽细菌病】空肠弯曲菌在鸡弧菌性肝炎中的作用机制及流行病学分析

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J L Jennings,L C Sait,C A Perrettet al., Campylobacter jejuni is associated with, but not sufficient to cause vibrionic hepatitis in chickens. Veterinary Microbiology, 2011, 149(1-2): 193-199.



鸡弧菌性肝炎（Vibrionic hepatitis），又称斑点肝病（Spotty liver disease），是一种严重影响家禽养殖业的疾病。长期以来，空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）被怀疑是引发该病的主要病原体，但其确切的致病作用和因果关系一直未能得到最终确认。本文基于Jennings等人（2011）的研究，系统性回顾和深度探讨了空肠弯曲菌在鸡弧菌性肝炎中的流行病学特征、体外侵袭能力、体内感染机制以及宿主免疫反应。研究证实，虽然患有斑点肝病的鸡肝脏中含有显著高水平的弯曲杆菌，但仅凭空肠弯曲菌的感染并不足以在健康宿主中复制出该疾病的病理特征。此外，宿主的T细胞介导的适应性免疫反应以及环境应激等易感因素在疾病的发展和清除中发挥了至关重要的作用。本文将详细综述该研究的实验方法、核心结果以及对公共卫生的深远影响。

1. 引言与疾病背景

鸡弧菌性肝炎，或称斑点肝病，是一种以家禽肝脏出现局灶性病变为特征的疾病。在临床和病理学上，这种病变通常表现为大小约为1至2毫米的灰白色斑点（Burch, 2005; Crawshaw & Young, 2003）。在更为严重的感染病例中，肝脏可能会出现高达4厘米的大面积坏死（Moore, 1958），并伴随有出血现象的发生（Hofstad et al., 1958; Sevolan et al., 1958）。该疾病最早于1954年被科学界首次描述（Tudor, 1954）。它对家禽养殖业的经济效益具有毁灭性的影响，具体表现为可导致产蛋量下降高达35%，发病率达到10%，而累积死亡率更是高达15%（Burch, 2005）。

在疾病被发现的初期，研究人员提出类似弧菌的微生物（后来被鉴定为空肠弯曲菌 Campylobacter jejuni）可能是导致该病的可能原因（Peckham, 1958）。随后，在1965年之前，科学界出现了更多关于该疾病的报道（Moore, 1958; Hofstad et al., 1958; Sevolan et al., 1958）。然而，令人费解的是，该疾病在1965年之后似乎一度销声匿迹，直到近年来才再次重新出现，引起了兽医学界和公共卫生领域的广泛关注（Crawshaw & Young, 2003）。

尽管空肠弯曲菌在早期就被认为与该疾病存在关联（Peckham, 1958），但这种细菌与斑点肝病特征性局灶性病变的发展之间，一直未能建立起决定性的联系。将弯曲杆菌属（Campylobacter spp.）作为引起该疾病的单一病原体的因果关系假说面临着一个巨大的挑战，因为后续的众多研究发现，这种微生物同样可以存在于表面看起来完全健康的禽类的肝脏中（Cox et al., 2006）。这一矛盾现象极大地复杂化了致病机制的研究。

为了解开这一科学谜团，研究人员开展了一系列深入的实验。主要研究目的包括：调查具有局灶性病变的鸟类肝脏中是否存在弯曲杆菌；探究这些细菌是否是健康鸟类产生此类病理学变化的病原体；以及评估实验性感染的鸟类是否能够对系统性感染的弯曲杆菌产生特异性的全身免疫反应。

2. 实验方法学深度解析

为了全面评估空肠弯曲菌的致病性及其在鸡肝脏中的定植情况，该研究采用了多维度的实验设计，涵盖了从田间样本采集到分子生物学鉴定，再到体外细胞模型和体内感染实验。

2.1 商业肉鸡肝脏中弯曲杆菌的定点分离

该研究选取了位于英国西南部的有机饲养肉鸡群。在8天的时间段内，于同一个加工厂对四个不同的鸡群进行了采样。这四个鸡群分别检查了18、51、50和50个肝脏样本。

在细菌分离方面，研究人员将100微升的肝脏组织匀浆涂布到改良的碳-头孢哌酮-脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA）平板上。为了提高检测的灵敏度，还对肝脏匀浆进行了弯曲杆菌富集培养：将6毫升组织匀浆接种到60毫升改良的Exeter肉汤中。培养容器顶部保留小于1厘米的顶空，盖紧盖子后在37°C下孵育48小时，随后将富集液划线接种到mCCDA平板上。

2.2 弯曲杆菌的分子鉴定与分型

每一株分离出的疑似弯曲杆菌都在Mueller Hinton肉汤（MHB）中过夜培养，培养条件为37°C的微需氧环境（5% O2，10% CO2，2% H2，余量为N2）。将培养物离心后重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过100°C加热10分钟释放DNA，并储存在-20°C备用。

为了精确鉴定到种的水平，研究使用了靶向lpxA、glyA和hipO基因的引物进行PCR扩增（Klena et al., 2004; Bang et al., 2002; Dingle et al., 2005）。PCR产物在紫外透射仪下可视化以确定条带大小。

此外，为了进行流行病学追踪，研究还采用了脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术。染色体DNA在1.3%琼脂糖块中裂解，并在25°C下使用20 U的SmaI酶切过夜。按照CAMPYNET提议的标准化参数进行电泳，通过这种方式，可以清晰地识别出同一鸡群中不同分离株的基因型差异。

2.3 鸡肝脏中弯曲杆菌的原位定量分析 (FISH)

为了直观地量化肝脏组织中的细菌载量，研究采用了荧光原位杂交（FISH）技术。肝脏组织被包埋在OCT基质中并在液氮冷却的异戊烷中速冻。切取6微米厚的切片并固定在载玻片上。

研究使用了两种探针：一种是特异性针对弯曲杆菌属的探针CAJEC01427（5'-AGC CCT AAG CGT CCT TCC-3'，带有5' Cy3标记）（Schmid et al., 2005），另一种是针对所有真细菌的特异性探针EUB 338（5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'，带有5' 荧光素标记）。通过荧光显微镜观察并随机选择十个视野，对组织中的细菌进行计数，这种方法极大地提高了原位病理分析的准确性。

2.4 体外侵袭能力评估（Caco-2细胞模型）

为了评估不同弯曲杆菌菌株的毒力，研究人员在体外建立并使用了Caco-2上皮细胞（ATCC HTB-37）模型。实验通过庆大霉素保护试验进行，细菌悬浮液根据吸光度调整为不同的感染复数（MOI：0.1、1、10、100和1000）。感染单层细胞后孵育2小时，随后用含有150微克/毫升庆大霉素的培养基洗涤并继续孵育2小时，以杀死所有细胞外的细菌。最后用0.1% Triton X-100裂解细胞，并在CBA平板上测定侵入细胞内的活菌总数。

2.5 空肠弯曲菌体内实验性感染模型

本研究严格遵守动物福利和生物安全规定。实验选用一日龄肉鸡，在严格的生物安全条件下饲养至三周龄，并随机分为每组30只的三个对照组。在确认所有鸟类均无弯曲杆菌感染后，在它们四周龄时进行口服灌胃感染。

实验组分别接种：从具有局灶性肝炎症状的肝脏中分离出的空肠弯曲菌3L44株（ CFU）；从家禽肠道分离出的空肠弯曲菌SC12940株（ CFU）；以及作为对照组的1毫升PBS。在感染后的第5天和第14天，分别处死各组中的15只鸡，并取出盲肠和肝脏进行微生物学分析。

2.6 肝脏特异性T细胞增殖反应分析

在感染后第14天，研究人员对肝脏组织进行了T细胞免疫应答分析。从感染3L44的禽类和未感染的禽类（各10只）身上解剖出肝脏，制备单细胞悬液。细胞用5 mM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行荧光标记。

随后，这些细胞与超声破碎的空肠弯曲菌3L44细胞蛋白（1微克/孔）或伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A）一起过夜孵育。使用抗鸡CD3-FITC抗体标记T细胞，并通过流式细胞术进行分析。通过检测CD3阳性细胞群体中CFSE荧光降低至少50%的细胞比例，来精确测量T细胞的特异性分裂和增殖情况。

3. 核心实验结果分析

3.1 商业肉鸡肝脏中弯曲杆菌的患病率

流行病学调查结果显示，四个被检测的鸡群均存在不同程度的斑点肝病，受影响的肝脏样本比例在6%（鸡群1和2）到8%（鸡群3和4）之间。不同鸡群的肝脏中弯曲杆菌的阳性率存在显著差异（P < 0.05），范围从8%到54%不等。

值得注意的是，定植在不同鸡群肝脏中的弯曲杆菌种类也表现出高度的多样性。鸡群1和鸡群2主要被结肠弯曲菌（C. coli）定植（分别占92.3%和77.8%），而鸡群3和鸡群4则完全被空肠弯曲菌（C. jejuni）定植。这表明引起或伴随此类病理现象的弯曲杆菌可能并非单一特定的菌株。

3.2 弧菌性肝炎与肝脏内高水平的弯曲杆菌相关

通过直接平板涂布法的比较发现，检测呈弯曲杆菌阳性的斑点肝脏数量（测试15个，阳性10个）显著高于健康的肝脏（测试185个，阳性59个）（P < 0.001）。

进一步的FISH分析提供了直接的原位定量证据。研究发现，表现出弧菌性肝炎病理特征的肝脏切片中，每个视野下的弯曲杆菌平均数量显著高于无病理特征的肝脏（P < 0.0001）。此外，双重探针染色（CAJECO1427和EUB338）结果揭示了一个关键细节：在斑点肝脏中，几乎没有观察到单独被EUB338染色而未被弯曲杆菌特异性探针染色的细菌。这强有力地证明了，弯曲杆菌是斑点肝脏组织中存在的主要细菌属，几乎排除了其他细菌属共感染作为主要病因的可能性。

3.3 实验性感染未能引发慢性肝脏再感染

从患有斑点肝病的鸡肝脏中成功分离出一株空肠弯曲菌，命名为3L44。该原始肝脏样本中含有极高载量的细菌（FISH分析显示平均每个视野有21.4个细菌）。同一鸡群中也分离出了与3L44具有相同PFGE图谱的菌株，以及具有不同PFGE图谱的菌株。

在Caco-2体外细胞模型中，相较于参考菌株NCTC11168和肠道分离株SC12940，肝脏分离株3L44表现出了极高的侵袭能力。

然而，在4周龄肉鸡的体内实验中，结果出乎意料。在感染后第5天，接种SC12940和3L44的鸟类盲肠中均检测到了空肠弯曲菌。3L44能够在盲肠中以显著高于SC12940的数量定植（P = 0.0007），并且这种高水平的盲肠定植在感染后14天仍能维持。但在肝脏定植方面，感染后第5天，SC12940组和3L44组分别只有13%和20%的鸟类在肝脏中检测出空肠弯曲菌。更重要的是，到了感染后的第14天，所有被分析的鸟类肝脏中空肠弯曲菌均转为阴性。研究人员在健康的实验宿主中未能复制出斑点肝病的病理学特征。

3.4 感染宿主对肝脏内的空肠弯曲菌产生特异性T细胞反应

为了解释体内实验中肝脏细菌被快速清除的现象，研究测试了细胞免疫应答。流式细胞术分析结果明确显示，与对照组相比，感染了空肠弯曲菌3L44的鸟类的CD3阳性肝细胞在受到抗原刺激后，表现出了显著更高程度的增殖反应（P = 0.0002）。这提供了坚实的证据，表明感染禽类能够启动针对系统性空肠弯曲菌感染的特异性适应性T细胞反应。

4. 深入讨论与机制探讨

传统观念通常认为，弯曲杆菌仅在家禽的盲肠中定植，并且属于共生关系，不会对宿主产生任何不利影响。然而，越来越多的证据表明，该生物经常从肠道外组织中被分离出来，而这些系统性扩散对宿主的具体影响仍是一个未解之谜。

4.1 科赫法则的挑战与疾病的多因素性质

本研究的数据确认了弯曲杆菌与鸡弧菌性肝炎之间强烈的流行病学和病理学联系。斑点肝脏中弯曲杆菌的检出率和绝对数量均显著高于健康肝脏，并且FISH结果排除了其他细菌作为主要致病菌的可能。

但是，为了满足科赫法则（Koch's postulates）以明确空肠弯曲菌就是鸡弧菌性肝炎的唯一病原体，研究利用强毒力肝脏分离株3L44进行了体内实验。结果表明，尽管该菌株在体外具有极强的上皮细胞侵袭力，并在体内盲肠中实现了极高密度的定植，但它并没有表现出对肝脏增加的趋向性，更没有在健康宿主中引发特征性的白斑病理变化。因此，本文的结论是：仅凭肝脏中存在弯曲杆菌这一单一条件，不足以引起鸡弧菌性肝炎。疾病的发生必然需要宿主内部其他诱发因素的协同作用。

4.2 适应性免疫清除与宿主应激假说

为什么商业养殖条件下的鸡会发病，而实验室条件下的鸡能够迅速清除感染？研究发现的肝脏局部特异性T细胞反应为解答这一问题提供了核心线索。在感染3L44的实验组中，强大的T细胞介导免疫反应可能直接促成了第5天和第14天肝脏中空肠弯曲菌的彻底清除。既往关于鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的研究也表明，显著的细胞免疫反应与感染的清除密切相关（Beal et al., 2005）。

实验鸟类和商业鸟类之间的巨大差异可能源于饲养环境、福利水平和品种差异。本研究中患病的商业鸟类来自有机饲养群，生长速度较慢且有户外活动通道；而实验组使用的是标准肉鸡。更重要的是，实验组的饲养条件符合极高的动物福利标准（低饲养密度、清洁垫料、良好的光照和环境丰富度）。

众所周知，恶劣的福利条件和压力会对动物的免疫系统产生负面影响。应激诱导的激素皮质酮（Corticosterone）在生理相关水平上已被证明会损害树突状细胞的MHC I类抗原呈递功能（Truckenmiller et al., 2005），从而导致T细胞功能受损。因此，合理的科学推测是：商业养殖环境下的应激导致了家禽的免疫抑制，使得空肠弯曲菌不仅能够突破肠道屏障，还能逃避肝脏的免疫清除，最终在大量增殖下引发组织坏死和斑点肝病。

4.3 重要的公共卫生影响

空肠弯曲菌不仅是家禽的病原体，更是人类食源性疾病的主要元凶。以往普遍认为零售家禽产品中的弯曲杆菌污染仅仅是由于加工过程中肠道内容物对肉类表面的交叉污染。然而，最近的研究在高达20-27%的深层组织样本中发现了弯曲杆菌。弯曲杆菌也经常从零售点的鸡肝中被分离出来。

鸡体内的肠道外弯曲杆菌对公共卫生构成了重大风险。因为存在于肝脏等深层组织内部的细菌，在烹饪过程中比表面污染的细菌更难被彻底消灭。苏格兰近期爆发的一起公共卫生事件充分印证了这一危险：该事件在三周内感染了48人，流行病学调查明确将其与食用鸡肝酱（Chicken liver pate）联系起来（O’Leary et al., 2009）。鉴于这种相当大的公共卫生风险，彻底阐明弯曲杆菌能够从胃肠道扩散到宿主内其他生态位的具体条件和机制，具有极其重要的科学价值和现实意义。

5. 结论

综上所述，空肠弯曲菌与鸡弧菌性肝炎（斑点肝病）的发生具有高度的关联性，且患病肝脏中的弯曲杆菌载量极高。然而，感染空肠弯曲菌本身不足以在健康的、处于良好福利状态下的家禽中诱发该疾病。家禽能够针对系统性的空肠弯曲菌感染启动有效的、基于T细胞的适应性免疫反应，从而快速清除肝脏中的细菌。未来需要进一步探讨诸如环境应激诱导的免疫抑制等易感因素，如何破坏这一免疫屏障并促发病理损伤，这不仅对于保障家禽养殖业的经济效益至关重要，也是防范食源性致病菌通过家禽脏器传播、保护人类公共卫生安全的关键环节。


附录1：文献表格表
1：用于分离自商业肉鸡肝脏的弯曲杆菌种类鉴定的引物



附录2：文献图释

图1 (Fig. 1)： 来源于四个商业饲养的有机鸡群的肝脏中弯曲杆菌阳性的患病率。鸡群1至鸡群4分析的样本量分别为n = 18, 51, 50 和 50。P值使用卡方分析（Chi-squared analysis）计算得出。

图2 (Fig. 2)： 健康和有斑点的肝脏组织中的弯曲杆菌（每组n=10），使用特定的FISH探针进行标记，并对10个随机选择的视野中存在的弯曲杆菌细胞数量进行计数。P值使用学生t检验（Student’s t-test）计算得出。

图3 (Fig. 3)： 使用庆大霉素保护试验，在一系列感染复数（MOI）下，检查了空肠弯曲菌（C. jejuni）3L44、NCTC 11168 和 SC12940 对 Caco-2 上皮细胞单层的入侵情况。数据是3个重复实验的平均值。灰条代表11168；黑条代表3L44；白条代表SC12940。

图4 (Fig. 4)： 肝脏分离株空肠弯曲菌（C. jejuni）3L44和肠道分离株SC12940在商业肉鸡中的感染情况。（a）感染后5天盲肠中的空肠弯曲菌3L44和SC12940。（b）感染后5天肝脏中的空肠弯曲菌3L44和SC12940。（c）感染后14天盲肠中的空肠弯曲菌3L44和SC12940。（d）感染后14天肝脏中的空肠弯曲菌3L44和SC12940。P值使用曼-惠特尼U检验（Mann–Whitney U test）计算得出。

图5 (Fig. 5)： 空肠弯曲菌在CD3阳性肝细胞中引起增殖反应。来自受感染（n = 10）和对照组（n = 10）鸟类的带有CFSE标记的肝脏单细胞悬液（SCSs），受到了超声破碎的空肠弯曲菌3L44的刺激。通过流式细胞术测量细胞中的荧光水平。针对ConA刺激的肝脏单细胞悬液进行增殖的标准化处理，将其视为已经历100%增殖。P值使用曼-惠特尼U检验计算得出。

附录3：参考文献 (Reference)

本研究的深度和严谨性建立在众多先驱学者的基础之上。在探讨鸡弧菌性肝炎的历史脉络时，Tudor (1954) 的首次描述和 Peckham (1958) 对弯曲杆菌潜在致病性的初步洞察奠定了整个研究领域的基石。关于该病造成的巨大农业经济损失（产蛋量急剧下降和高死亡率），Burch (2005) 的数据提供了明确的背景支持。

在流行病学调查的矛盾性分析中，Cox et al. (2006) 发现健康禽类肝脏中同样存在弯曲杆菌，这一关键文献直接促使了本研究深入探究致病性的必要因素。方法学方面，准确鉴定所不可或缺的PCR靶向基因，高度依赖于 Klena et al. (2004) 对lpxA基因的研究以及 Bang et al. (2002) 对hipO基因的引物设计，此外 FISH 探针的精准定位得益于 Schmid et al. (2005) 的技术开发。

对于本研究最核心的“免疫清除”假说，Beal et al. (2005) 在沙门氏菌感染模型中发现的T细胞介导免疫反应提供了重要的理论支持。同时，为了解释为何商业养殖鸡群更容易发病，Truckenmiller et al. (2005) 关于皮质酮（压力激素）损害抗原呈递的机制研究，为“应激诱导发病假说”提供了坚实的病理生理学依据。最后，本研究的重要现实意义通过 O’Leary et al. (2009) 记录的由于食用含弯曲杆菌的鸡肝酱而引发的群体感染事件得到了凸显。以下10篇核心文献贯穿了本文的历史背景、方法学建立、机制探讨及公共卫生预警四个核心维度。

来源: 菌中无戏言, 作者: 凤凰于飞