【分享】从DNA到进化树：一篇文章搞定细菌16S鉴定全流程

与你分享

从DNA到进化树：一篇文章搞定细菌16S鉴定全流程

做微生物研究的朋友都知道，鉴定一个细菌“姓甚名谁”是经常要面对的任务。传统的形态学观察和生理生化实验耗时费力，同时培养基上很多细菌会有相似的菌落外观。因此，16S rRNA基因测序+ BLAST比对已成为最主流、最高效的解决方案。




01、细菌鉴别为什么是16S？

首先解决一个核心问题：为什么细菌鉴定都盯着16S rRNA基因不放？这个基因全长约1500 bp，它同时具备“保守”与“可变”两大特性。



保守区：就像家族里的姓氏，在整个细菌界都高度相似，便于我们设计通用引物把它们“抓”出来。

可变区：就像家族成员的名字，包含了9个高变区域（V1-V9），蕴含着物种特异的序列信息。

通过测序获得这些可变区的序列，就等于拿到了细菌的“身份证号”，可以用来和数据库里的已知物种进行比对。

02、样品送测流程



1. DNA提取与质控

首先从样本（粪便、土壤、水体或纯菌落）中提取总DNA。这一步非常关键，DNA的纯度和浓度直接影响后续PCR的成功率。通常会使用Qubit等精密仪器对DNA进行定量，并稀释到合适的浓度（如5 ng/μL）。

2. PCR扩增（扩增子获取）

这是最核心的一步。针对16S rRNA基因保守区的通用引物，通过聚合酶链式反应（PCR），把微量的特定基因片段“复印”出成千上万份。根据研究目的，可以选择扩增不同的可变区（如V1-V2、V3-V4、V4等）。V3-V4区是目前最常用的组合之一。

3. 文库构建与上机测序

扩增出来的产物还不能直接上机，需要加上测序用的“接头”和样品专属的“条形码（Barcode）”以便区分不同的样本。这个过程叫做文库构建。建好的文库经过纯化和质量控制后，就会被加载到高通量测序仪（如Illumina MiSeq平台）上进行测序。测序完成后，你会收到一个包含大量序列数据的文件（FASTQ格式），这就是后续生物信息分析的“原材料”。

03、BLAST分析比对
      
拿到测序数据后，对于纯菌的Sanger测序结果，或者你想挑取某个特定的OTU/ASV序列进行鉴定，最直接的方法就是用NCBI的BLAST工具。 BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）就是那把鉴定物种身份的钥匙。它能把你的未知序列和数据库里海量的已知序列进行比对。

以下是详细的图文操作指南：

第一步：进入BLAST页面

打开浏览器，访问NCBI的BLAST首页，点击 “nucleotide BLAST” (核苷酸序列比对)。



第二步：输入你的查询序列

在“Enter Query Sequence”框中，粘贴你的16S rRNA序列。注意格式：需要是FASTA格式（以“>”符号开头，后接序列名称，换行后是碱基序列）。



第三步：选择专门的数据库

在“Choose Search Set”部分，默认是“Standard databases (nr etc.)”。建议切换到“rRNA/ITS databases”。在下拉菜单中选择 “16S ribosomal RNA sequences (Bacteria and Archaea)”。这是一个经过NCBI专家人工校验的高质量数据库，包含来自模式菌株的序列，物种名称也是最新的，可以极大避免注释错误。

第四步：点击“BLAST”并等待结果

点击页面底部的蓝色“BLAST”按钮。等待几秒到几分钟不等，结果页面就会刷新出来。

第五步：解读BLAST结果页面

1）Graphic Summary (图形汇总)：在顶部会有一个彩色条带图，显示你的序列和哪些数据库序列匹配上了，颜色越深代表匹配度越高。

2）Descriptions (序列描述列表)：这是最核心的部分，列出了与你的序列最相似的“Top Hits”。

3）Description：查看物种名称。

4）Ident：百分百一致性（Percent Identity）。对于16S鉴定，通常认为 > 99% 可以鉴定到“种”水平，> 97% 鉴定到“属”水平。

5）Accession：该参考序列在NCBI的编号。

6）Alignments (具体比对详情)：点击某个物种前面的Accession链接，可以看你和这个物种具体的碱基配对情况。中间的“|”号代表碱基一致，没有“|”的地方就是差异位点。


04、系统发育进化树绘制

BLAST结果只能告诉你“和谁最像”，但无法直观展示你手中的菌株与近缘物种之间的演化关系。这时就需要绘制系统发育进化树（Phylogenetic Tree）。进化树就像一份“家族谱系图”，能够清晰展示物种间的亲缘远近。下面介绍两种最常用的方法。



方法一：NCBI一站式快速建树

NCBI的BLAST页面内置了一个简易的建树工具，无需安装任何软件。

操作步骤：

1）在BLAST结果页面，勾选你感兴趣的参考序列（建议选择 Top 10-15 条不同物种的序列，再选1-2条远缘的外群序列作为“根”）。

2）系统会自动基于比对结果构建一棵邻接树（Neighbor-Joining Tree）。

3）页面刷新后，你就能看到一棵带分支的树状图。鼠标悬停在节点上可以查看靴带值（Bootstrap value，一般 > 70% 认为分支可靠）。

优缺点：

优点：零门槛、纯网页操作、速度快。缺点：树图样式单一，无法进行深度美化，且当序列数量过多时浏览器容易卡顿。

方法二：MEGA软件建树

如果是要用于论文发表或学位论文，推荐使用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）软件。这是目前最流行的分子进化分析免费软件。

完整操作流程：

第一步：下载与安装

访问MEGA官网（www.megasoftware.net），下载最新版本（目前为MEGA 12），支持Windows/Mac/Linux全平台。

第二步：准备多序列文件

将你的待测序列和多条参考序列（从BLAST结果中复制FASTA格式）合并到一个文本文件中，保存为 “.fas” 或 “.fasta” 格式。

注意：建议将序列进行多序列比对（Multiple Sequence Alignment）后再建树，MEGA内置了比对功能（Muscle或ClustalW）。

第三步：在MEGA中导入并比对

打开MEGA，点击 “Align” → “Edit/Build Alignment” → 选择 “Create a new alignment” → 选择 “DNA”。

点击 “File” → “Open”，导入你的FASTA文件。

点击 “Alignment” → “Align by Muscle (or ClustalW)”，软件会自动进行多序列比对。比对完成后，删除两端不齐平的多余碱基（通常保留比对后的公共区域）。

第四步：构建系统发育树

比对完成后，点击 “Data” → “Phylogenetic Analysis”，进入建树模块。点击 “Phylogeny” 菜单，你会看到多种建树方法：

1）NJ（Neighbor-Joining，邻接法）：计算速度快，适合大体量数据，最常用。

2）ML（Maximum Likelihood，最大似然法）：统计学基础更扎实，结果更准确，但计算耗时较长，适合小规模数据。

3）MP（Maximum Parsimony，最大简约法）：适合亲缘关系较近的序列。

第五步：参数设置与运行


以NJ法为例：

点击 “Neighbor-Joining Tree”。在弹出的对话框中，Bootstrap method 建议选择 “Bootstrap”，Replications（重复次数）设置为 1000。Substitution Model 选择 “Kimura 2-parameter”（K2P模型，是16S建树的常用核苷酸替代模型）。点击 “Compute”，等待运行结束。

第六步：进化树的美化与导出

树建好后，MEGA提供了丰富的美化功能：

1）调整分支样式：点击“Tree” → “Tree Layout”，可以选择矩形树、圆形树或辐射树。

2）显示靴带值：默认会显示在分支节点上，如果数值太小（<50%）可以考虑不显示或打上“*”号标注。

3）标注你的菌株：找到你的菌株对应的叶子节点，右键 → “Edit Label”，可以将其标红或加粗。

4）导出图片：点击 “File” → “Export” → 选择 “PDF/SVG/PNG/TIFF” 等格式。推荐导出为PDF或SVG（矢量图），便于后期在AI或PPT中继续编辑。

备注：需要进行美化的可以使用itol进行美化。


来源：大橘为重的医