重组多表位杆状病毒增强 H9N2 亚型禽流感灭活疫苗对异源病毒的保护效果

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重组多表位杆状病毒增强 H9N2 亚型禽流感灭活疫苗对异源病毒的保护效果
谢梓民1，#，陈滢仪1，#，谢俊1，杜珊瑶1，陈荣茂1，郑宇芩1，尤博文1，冯敏1，廖明1，2，*，代曼曼2，*
（1 华南农业大学 兽医学院 / 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室 / 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广州 510642；2 中英禽病国际研究中心，广州 510642）

摘 要：尽管使用灭活疫苗在很大程度上控制了禽流感（AI）疫情的爆发，但它们未能完全防止病毒的传播。为提高H9N2禽流感病毒（AIV）灭活疫苗（InV）的免疫效果，我们构建了一种重组多表位杆状病毒（BV-BNT），该病毒包含H9N2 AIV的2个B细胞表位和9个T细胞表位，与InV联合免疫并评估其对异源病毒的保护效果。结果显示，与InV组相比，InV+BV-BNT免疫组的HI抗体滴度、IgG和IgM水平，以及B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和CD4+CD8+ T细胞的比例均显著提高。此外，InV+BV-BNT组的IL-1β、IFN-γ、IFN-α、IL-4、IL-13和CXCLi1的表达水平显著高于InV组。此外，四种保守肽（NP182-190、NP455-463、NS198-106和NP380-393）在InV+BV-BNT组中能显著刺激脾细胞表达IFN-γ，而在InV组中未观察到这一现象。在攻毒保护试验中，与InV组相比，InV+BV-BNT组在感染后第3天（3 DPI）CD4+ T和CD8+ T细胞的比例显著上调。其次，InV+BV-BNT组的口咽部病毒载量在3 DPI时显著低于InV组。此外，InV+BV-BNT组在感染后第5天（5 DPI）口咽和泄殖腔拭子的病毒阳性率较低，并且在感染后第7天（7 DPI）未检测到阳性样本。因此，本研究表明，InV与BV-BNT联合免疫可诱导更强的体液和细胞免疫反应，缩短病毒排毒期，并降低病毒载量，表明BV-BNT可以作为H9N2灭活疫苗的补充疫苗，以提高其保护效果。

关键词：H9N2 AIV；杆状病毒；灭活疫苗；B细胞表位；T细胞表位

H9N2禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是中国家禽中流行的主要亚型。该病毒不仅导致蛋鸡产蛋量下降，还可为高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）提供内基因片段，促使新毒株的出现，从而对公共卫生构成严重威胁。尽管H9N2灭活疫苗（InV）已在中国广泛用于控制家禽H9N2感染，但其免疫效果并不完全可靠。偶尔仍可在接种了灭活疫苗的鸡群中检测到病毒排毒。

由于T细胞表位的保守性和广谱性，近年来疫苗研究逐渐转向能够刺激细胞免疫反应的策略。筛选和鉴定针对AIV的T细胞表位是开发能够诱导细胞免疫应答疫苗的前提。有研究表明，流感病毒血凝素（HA）蛋白的HA2亚基中76-130位氨基酸序列在不同亚型的流感病毒中高度保守，基于HA2的合成肽疫苗可为小鼠提供针对H3N2、H1N1和H5N1等不同亚型流感病毒的保护。此外，M2蛋白的外部结构域（M2e）因其在人和禽流感病毒中的高度保守性，被认为是通用流感疫苗的重要靶点。核蛋白（NP）的氨基酸380-393位（NP380-393）作为流感病毒的保守表位，可诱导交叉抗体和细胞免疫应答。Reemers等人报道，NP190-197、NP339-347和NP251-259可刺激肺部淋巴细胞产生IFN-γ。Jia等人鉴定了四个保守的T细胞表位（NP182-190、NP455-463、NS198-106和PB2552-560），可刺激记忆淋巴细胞产生IFN-γ。Xiao等人将T细胞表位M2e44-53与其他B细胞表位和CD4+ T细胞表位结合，结果增强了细胞和体液免疫反应。基于这些研究，我们推测多保守B和T淋巴细胞表位联合免疫可能是对抗H9N2感染的有效策略。

在本研究中，我们利用杆状病毒表达系统构建了一个包含H9N2的2个B细胞表位和9个T细胞表位的多表位重组杆状病毒（BV-BNT）。更重要的是，我们不仅评估了InV与BV-BNT联合免疫的效果，还在免疫保护试验中验证了病毒排毒与细胞免疫的相关性。

2 材料与方法


2.1 细胞与病毒

昆虫卵巢细胞（Sf9；本试验室保存）；鸡胚成纤维细胞（DF-1；本试验室保存）；商用禽流感病毒（H9）灭活疫苗（H9N2 SS株，h9.4.2.3谱系，≥5×107EID50/0.1 mL）购自华南生物医药有限公司（广州，中国）。低致病性禽流感H9N2亚型HN毒株（A/Chicken/Hunan/HN/2015）由本试验室分离鉴定，该毒株属于h9.4.2.5谱系。

2.2 重组杆状病毒的构建及表达

H9N2多表位BNT表达盒包含2个B细胞表位（HA276-130，M2e2-24）和9个T细胞表位（NP182-190、NP455-463、NS198-106、PB2552-560、NP380-393、M2e44-53、NP190-197、NP339-347、NP251-259）。该基因片段由通用生物公司（安徽，中国）合成，并克隆至pFastBac-VSVG杆状病毒转移载体，在人巨细胞病毒（CMV）启动子的控制下表达。BV-BNT及野生型杆状病毒（BV-WT）在Sf9细胞中增殖，并在Sf-900TM II SFM无血清培养基中培养于27℃，随后使用Beyotime（上海，中国）的慢病毒浓缩试剂盒进行病毒颗粒浓缩。杆状病毒滴度通过BD BacPAKTM杆状病毒快速滴定试剂盒（Takara，日本）测定。

以MOI=50的感染复数（MOI）感染六孔板中长满单层的DF-1细胞，感染48 h后收集蛋白样品进行Western Blot鉴定蛋白的表达。蛋白在LI-COR Odyssey成像系统下通过化学发光检测。

2.3 间接免疫荧光分析（IFA）

在六孔板中接种Sf9和DF-1细胞，并以MOI=50的感染复数感染杆状病毒颗粒。感染后48 h，用4%多聚甲醛（Biosharp，北京，中国）固定30 min。固定细胞后，用0.25% Triton X-100（Yeasen，上海，中国）处理30 min。随后，用5%牛血清白蛋白（BSA）（Sangon，上海，中国）封闭。BV-BNT蛋白通过抗His标签小鼠单克隆抗体（Proteintech，美国芝加哥）孵育后，再使用FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗（Abcam，英国剑桥）孵育。最终，在荧光显微镜（Leica，DM5000B，德国）下观察荧光信号。


2.4 动物试验

60只2周龄无特定病原（SPF）白来航鸡（购自广东大华农动物保健品有限公司，广东，中国），随机分为四组：InV+BV-BNT组、InV+BV-WT组、InV组和PBS对照组，每组15只鸡。PBS对照组经肌肉注射500 μL PBS。InV+BV-BNT组、InV+BV-WT组和InV组均在2周龄时肌肉注射500 μL灭活疫苗（≥2.5×108EID50）。初次免疫后2周，InV+BV-BNT组经肌肉注射109斑块形成单位（PFU）的BV-BNT，InV+BV-WT组经肌肉注射109 PFU的BV-WT，均以500 μL PBS稀释。而InV组及对照组均注射500 μL PBS。加强免疫后2周，所有鸡只均经鼻腔滴注H9N2亚型HN毒株（A/Chicken/Hunan/HN/2015），病毒剂量为107EID50/200 μL。

在加强免疫后2周，收集所有鸡只的血清样本。在感染前1天（DBI）和感染后3天分别从每组随机选择3只鸡，静脉注射戊巴比妥（200 mg/kg）进行安乐死，并收集组织样本。试验期间，分别在3 DPI、5 DPI和7 DPI，从每组9只鸡收集口咽拭子和泄殖腔拭子，并用EID50法进行病毒滴度测定。

2.5 血清学检测

对加强免疫后2周收集血清样本进行HI检测。HI检测采用4个血凝单位（HAU）的异源h9.4.2.5谱系抗原（A/Chicken/Hunan/HN/2015），按照世界动物卫生组织（WOAH）标准方法进行。此外，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）（Cloud-clone，武汉，中国）检测血清IgG、IgM和IgA抗体水平。

2.6 淋巴细胞分离

淋巴细胞的分离按照Dai等的描述进行。脾细胞的分离在RPMI 1640培养基（Gibco，CA，美国）中进行，并使用组织单个核细胞提取试剂盒（Haoyang，天津，中国）按照生产商的说明操作。按照该试剂盒的组织分离步骤进行细胞提取，并使用相同的分离液进行梯度离心，以获得脾脏淋巴细胞。

2.7 流式细胞术

将3×105PBMCs或脾细胞分别与APC标记的抗鸡CD3+抗体（SouthernBiotech，美国伯明翰）、FITC标记的抗鸡CD4+抗体（SouthernBiotech，美国伯明翰）和PE标记的抗鸡CD8α+单克隆抗体（SouthernBiotech，美国伯明翰）同时孵育，在4℃避光反应30 min。随后，细胞悬液用PBS洗涤3次，最终使用流式细胞仪（CytoFLEX，贝克曼库尔特，美国Brea）进行检测。流式数据通过FlowJo V10（Tree Star，美国Ashland）软件分析。

2.8 qRT-PCR检测免疫相关基因

PBMCs按照Dai等的方法分离后，使用RNA提取试剂盒（Magen，广州，中国）提取总RNA，并用DNase I（Takara Bio，日本滋贺）处理后，进行反转录反应。qRT-PCR在ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems，美国Waltham）上进行，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京，中国），按照生产商的推荐规格进行操作。GAPDH基因用作内参基因。采用2-△△Ct方法进行相对定量分析。每组设置3个生物学重复，每个样本进行3次技术重复。qRT-PCR所使用的引物参照已有研究。

2.9 IFN-γ酶联免疫斑点（ELISpot）试验

按照鸡IFN-γ ELISpot BASIC试剂盒（Mabtech，美国）的说明进行。试验采用脾细胞对特定肽段刺激后产生的斑点数量来评估疫苗的免疫原性，使用自动斑点分析仪（Mabtech，美国）进行计数。若某肽段能够在3只鸡中的至少2只诱导显著的IFN-γ分泌，则认为该肽段具有免疫原性。

3 结果

3.1 重组杆状病毒的构建

如图1A所示，我们成功构建了BV-BNT，该病毒携带一个包含2个B细胞表位、9个T细胞表位、柔性连接肽（GGGGS）、6个His标签以及转录终止子的基因盒。Western blot结果显示，在BV-BNT感染的细胞中检测到分子量约为56 kDa的BNT蛋白（图1B）。此外，间接免疫荧光检测（IFA）进一步证实，在BV-BNT感染的细胞中观察到显著的荧光信号，而在BV-WT感染的细胞中未检测到荧光信号（图1C）。

A：重组多表位杆状病毒的结构示意图；B：重组多表位杆状病毒的蛋白表达；C：重组多表位杆状病毒和野生型杆状病毒在Sf9和DF-1细胞中的蛋白表达情况
图1 重组多表位杆状病毒的结构示意图及体外表达分析

3.2 SPF鸡接种不同疫苗后的体液免疫反应

如图2所示，免疫组的HI抗体滴度、IgM和IgG水平以及B淋巴细胞比例均显著高于 PBS对照组（图2B-G）。特别是，在免疫组中，InV+BV-BNT组的HI抗体滴度、IgM和IgG水平以及B细胞比例显著高于InV组和InV+BV-WT组（P < 0.05）。然而，各组之间的IgA和sIgA水平无统计学差异（图2E和2F）。


A：疫苗免疫示意图（蓝色为该部分试验内容）；B-G：疫苗诱导的体液免疫反应特性图2 疫苗诱导SPF鸡体液免疫反应的特性

3.3 PBMCs中T细胞比例及免疫相关基因表达

如图3所示，我们发现InV+BV-BNT组的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和CD4+CD8+ T细胞的比例在所有免疫组中最高（P < 0.01，图3A-C）。此外，免疫相关基因的表达水平检测结果表明，IL-1β、IFN-γ、IFN-α、MHC-II、IL-4、IL-13、CXCLi1和CXCLi2的表达水平在InV+BV-BNT组中显著高于PBS组（P < 0.05，图3D-3G）。特别是，与其他免疫组相比，InV+BV-BNT组的IL-1β、IFN-γ、IFN-α、IL-4、IL-13和CXCLi1的表达水平最高（P < 0.05）。


A-C：加强免疫后外周血单个核细胞中CD4+，CD8+以及CD4+CD8+的比例；D-G：免疫相关因子表达量
图3 疫苗诱导SPF鸡细胞免疫反应的特性

3.4 IFN-γ ELISpot分析不同免疫组的T细胞应答

图4结果显示，在InV+BV-BNT组中，NP182-190、NP455-463、NS198-106和NP380-393肽段可显著诱导脾细胞分泌IFN-γ（P < 0.05，图4A）。相比之下，在InV组和InV+BV-WT组，这些特定肽段均未能有效诱导IFN-γ的表达（图4B-4C）。


图4 IFN-γ ELISpot检测检测表位刺激T细胞效应应答

3.5 免疫后异源H9N2的攻毒保护试验

图5结果表明，在3 DPI，所有试验组的口咽拭子病毒阳性率均为 100%（9/9），但InV+BV-BNT组的病毒滴度显著低于InV 组（P < 0.05，图5B）。在5 DPI，InV+BV-BNT组的口咽拭子病毒阳性率（44.44%，4/9）低于InV组（77.78%，7/9）。在 7 DPI，InV+BV-BNT组的口咽拭子中未检测到病毒（0%），而PBS组、InV组和InV+BV-WT组仍然呈阳性（图5B和补充表1）。在泄殖腔病毒排毒方面，在5 DPI，InV+BV-BNT组的病毒阳性率（11.11%，1/9）低于InV组（33.33%，3/9）。在7 DPI，所有免疫组的泄殖腔拭子中均未检测到病毒（图5C）。此外，我们检测了3 DPI 时各组织器官中的病毒载量。与PBS组相比，InV+BV-BNT组的脑、肺、脾、肾和回肠的病毒载量显著降低（P < 0.05，图5D）。然而，在InV组中，仅十二指肠的病毒载量显著低于PBS组（P < 0.05）。此外，InV+BV-BNT组的十二指肠和空肠病毒阳性率为66.67%（2/3），而其他组的病毒阳性率为100%（3/3）。

最后，我们检测了病毒攻毒后PBMCs中T淋巴细胞的比例变化。在3 DPI 时，InV+BV-BNT组的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的比例显著高于PBS组、InV组和InV+BV-WT组（P < 0.05，图5E和5F）。


A：疫苗免疫示意图（蓝色为该部分试验内容）；B：咽拭子排毒量；C：泄殖腔拭子排毒量；D：组织病毒载量；E和F：加强免疫攻毒后外周血单个细胞中CD4+和CD8+T细胞比例
图5 疫苗免疫SPF鸡后对异源H9N2 AIV的保护作用

4 讨论

鸡的T细胞，特别是CD4+和CD8+ T细胞，在抗病毒感染中至关重要，但传统灭活疫苗主要诱导体液免疫，难以有效激活细胞免疫，导致疫苗接种鸡仍可能排毒，影响保护效果。本研究采用多表位重组杆状病毒与H9N2灭活疫苗联合免疫，以增强体液和细胞免疫应答，提高疫苗保护力，减少病毒排毒、降低病毒阳性率并缩短排毒期。

多表位疫苗因其针对性强且可诱导特定表位的免疫应答，被认为是改进禽流感疫苗的新策略。已有研究表明，HA276-130、M2e2-24、NP380-393、M2e44-53、NP190-197、NP339-347、NP251-259等表位可有效增强AIV的免疫保护。然而，以往研究大多侧重于单一表位或单一免疫方式，本研究则整合了9个T细胞表位和2个B细胞表位，构建了多表位重组杆状病毒BV-BNT，并通过ELISpot实验进一步验证了其在诱导T细胞免疫应答方面的优势。与传统灭活疫苗相比，InV+BV-BNT组表现出更强的HI抗体滴度、IgG和IgM水平，并显著增加PBMCs中B淋巴细胞比例。此外，与先前研究仅评估HI抗体水平不同，我们进一步检测了免疫相关基因的表达，发现IL-1β、IFN-γ、IFN-α、MHC-II、IL-4、IL-13、CXCLi1和CXCLi2等基因在InV+BV-BNT组显著上调，表明该策略在激活体液和细胞免疫方面均优于单独使用灭活疫苗。

目前，禽流感疫苗对异源病毒的交叉保护能力仍然有限。本研究的病毒攻毒试验进一步表明，与传统灭活疫苗相比，联合免疫策略在减少病毒排毒方面更具优势。在3 DPI时，InV+BV-BNT组的口咽部病毒排毒显著低于InV组，5 DPI时口咽和泄殖腔拭子的病毒阳性率进一步降低，且3 DPI时CD4+ 和CD8+ T细胞比例显著升高。相较于之前的研究仅关注病毒滴度下降，本研究还首次证明了联合免疫可提高T细胞比例，并增强早期病毒清除能力。此外，尽管InV+BV-BNT组和InV组在所有组织中的病毒载量差异未达到统计学显著水平，但大多数器官中InV+BV-BNT组的病毒载量均低于PBS组，这一结果进一步表明，多表位疫苗可在体内发挥更广泛的保护作用。

已有研究表明，基于表位的疫苗可有效增强CD4+和CD8+ T细胞应答，这在清除病毒和提供长期免疫保护方面至关重要。然而，之前的研究大多使用单一表位疫苗或单独分析T细胞比例，而本研究通过联合免疫策略显著提高了T细胞应答，并在体液免疫、细胞免疫以及病毒排毒控制方面均表现出优越性。这些结果不仅验证了InV+BV-BNT联合免疫在实验条件下的有效性，同时也进一步证明了其在减少病毒排毒、降低病毒载量及缩短排毒期方面的优势。

5 总结


综上所述，我们构建了一种H9N2 AIV多表位重组杆状病毒疫苗，该疫苗包含H9N2 AIV的2个B细胞表位和9个T细胞表位。研究结果表明，与单独接种H9N2灭活疫苗相比，联合免疫H9N2灭活疫苗和BV-BNT可增强体液和细胞免疫应答，减少病毒排毒，并缩短病毒排毒期。本研究结合了可诱导T细胞应答的多表位疫苗与可诱导血凝素抗体的传统疫苗，强调了在H9N2病毒防控中接种疫苗的重要性，特别是通过增强CD4+和CD8+ T细胞应答以提高疫苗保护效力。因此，H9N2 AIV多表位重组杆状病毒疫苗为解决H9N2灭活疫苗的保护缺陷提供了一种新的候选策略，并具有广阔的应用前景。

参考文献：略

来源：广东省畜牧兽医协会