【分享】禽流感饮水和喷雾免疫为H9N2和H5N1防控提供新思路

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近年来，H5N1 和 H9N2 禽流感在全球家禽业中长期流行，不仅威胁养殖效益，也增加公共卫生风险。

近期 npj Vaccines 发表的一项研究，利用基因重排构建二价减毒活疫苗，并采用气溶胶首免结合饮水强化的方式，在实验条件下同时评估其对 H9N2 和高致病性 H5N1 的保护效果，为规模化养殖场提供了新的防控思路。


一、为什么又是 H9N2 和 H5N1？
过去二十多年里，H5N1 高致病性禽流感几乎成了“家禽业噩梦”的代名词：

在鸡群中致死率极高；爆发后往往要扑杀大批禽只，带来巨大的经济损失；还不时出现人感染病例，给公共卫生带来压力。

与此同时，H9N2 虽然是低致病性病毒，但在亚洲、中东等地区早已“常驻”，可以造成持续的呼吸道问题、产蛋下降和易感性增加，

而且自身也有一定的人畜共患风险；更重要的是，它经常参与重配，为新型 H5/H7 等高致病毒株提供“基因片段”。

传统灭活疫苗虽然在很多国家被广泛使用，但也存在一些痛点：

多数需要人工逐只注射，劳动量大；对漂移毒株的交叉保护有限，容易“跟不上病毒变异”；对黏膜免疫、细胞免疫的激活相对有限。

因此，研究者希望开发一种既适合大群免疫场景，又能兼顾广谱保护和 DIVA 监测 新型疫苗策略——这就是本文主角：

二价 H9N2/H5N2 基因重排活疫苗（MLV-H9N2-IL / MLV-H5N2-IL）以及 “气溶胶首免 + 饮水强化” 的序贯免疫方案。

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二、疫苗长什么样？怎么打？


（一）基因重排 RAM 平台：既活又“拴住手脚”
这套活疫苗并不是简单的弱毒株，而是基于 基因组重排（RAM）技术 设计的安全骨架：

1.用 H9N2 的 WF10 母本病毒作为骨架；

2.通过在 PB1、M2 等基因片段中“动手脚”，让病毒具备良好的免疫原性，却难以与野毒重配、难以传播；

3.在 NA 末端还接上了鸡 IL-18（免疫增强因子），有助于偏向 Th1 型应答、增强细胞免疫。

在此基础上，分别换上：H9 HA（来自埃及鸡源 H9N2 毒株）；H5 HA（来自美国火鸡源的 2.3.4.4b H5N1 毒株，但剪掉了高致病性裂解位点）；

组合成一个 二价 H9N2/H5N2 活疫苗，理论上既能针对常见 H9N2，又为 H5N1 提前“打地基”。

（二）气溶胶首免 + 饮水强化：贴合产业实际
试验选用 1 日龄 SPF 白来航雏鸡：

1、首免（day 0）

a.把小鸡放入专门设计的 静置气溶胶舱；b.用雾化器在舱内喷入含疫苗的气溶胶，暴露 15 min；c.估算每只鸡吸入的剂量约为 10? EID??；d.之后再通风 5 min，把残余气溶胶排出。

2、强化免疫（day 14）

a.将疫苗稀释到饮水中，配合去氯剂、pH 调节剂；b.先停水 6 h，再用“钟形饮水器”供给 2 h，让鸡集中饮用；c.剂量同样控制在 10? EID??/mL 的水平。

3、对照组包括

a.只打 H9 单价活疫苗；b.二价活疫苗首免不强化（prime only）；c.传统的 H9N2/H5N2 油佐剂灭活疫苗，皮下注射首免+强化；d.完全未免疫的空白对照。

研究者在首免后对咽拭子、泄殖腔拭子进行检测，发现活疫苗只在第 1 天咽拭子中短暂检出，到了第 3 天就基本检测不到，泄殖腔更是全程阴性——说明 疫苗复制有限、安全性较好。


图1. 一日龄雏鸡经气溶胶免疫后，MLV减毒活疫苗仅发生有限复制。
三、抗体强不强？谁来主导保护？


（一）抗 H9 抗体：滴度稳稳在线
在首免后 14 天、强化后 14 天，研究者分别检测：

1、H9 血凝抑制（HI）抗体：

无论是单价 H9 活疫苗、二价活疫苗还是灭活疫苗，首免后都能产生可观的 H9 HI 滴度；灭活疫苗的滴度普遍更高一些，但活疫苗在强化后也能再升高 2 倍左右；二价活疫苗首免+饮水强化的组合，H9 中和能力与灭活疫苗相当。

2、H5 HI 抗体：

不论单价或二价活疫苗，H5 HI 几乎检测不到；灭活疫苗组中只有少数个体能检测到低水平 H5 HI 抗体。

中和实验（使用携带 Nanoluciferase 的 H9N1/H5N1 重组病毒）进一步验证：a.针对 H9 的中和滴度，二价活疫苗 prime-boost 与灭活疫苗均表现良好；b.针对 H5 的中和滴度，几乎只有灭活疫苗组有明显反应。


图2. 气溶胶联合饮水免疫诱导了针对H9的强烈HI应答，但针对H5的应答较弱。
（二）ELISA：NA 和 NP 抗体给出更多线索
研究还用 ELISA 检测了更多抗原的抗体反应：

1.抗 H9 HA 抗体：活疫苗和灭活疫苗在首免后即明显升高，强化后进一步提高；

2.抗 H5 HA 抗体：整体很弱，只在部分个体中可见低水平反应；

3.抗 NP 抗体：二价活疫苗首免后 NP 抗体水平最高，强化后各免疫组 NP 抗体差异缩小；

4.抗 N2 NA 抗体：所有含 N2 成分的疫苗组均产生了较强的 N2 抗体，强化后进一步升高；

5.抗 N1/N8 NA 抗体：基本为阴性。

这些结果说明：

1.气溶胶 + 饮水的活疫苗程序，足以诱导稳健的抗 H9 和抗 N2 体液免疫；

2.对 H5 的经典 HI / 中和抗体虽弱，但并不意味着完全没有保护（这一点在后面的 H5N1 攻毒中有惊喜）；

3.因为疫苗只含 N2，而野外 H5N1 携带的是 N1，利用 NA 抗体谱，理论上可以实现 DIVA 监测——区分“打过 H5N2 疫苗”和“自然感染 H5N1”。


图3. 通过ELISA检测到强烈的抗H9、抗N2和抗NP抗体应答
四、对 H9N2 的“同源+漂移”双重考验
接下来，研究者在 4 周龄时设置两种 H9N2 攻毒：

1.同源毒株 ck/EGY（与疫苗 H9 片段高度同源）；

2.抗原性漂移毒株 ck/SX，HA 有显著差异。

首先，他们先做了一个交叉 HI 测试：

1.用免疫鸡的血清去抑制同源毒株，HI 滴度很高；

2.换成漂移株，几乎完全不抑制——说明传统意义上的交叉 HI 抗体非常有限。

然而，真正的攻毒结果却非常“惊喜”：

1. 同源 H9N2 攻毒：达到“灭菌性免疫”
a.未免疫对照组：咽拭子排毒持续 6 天，泄殖腔排毒 4 天；

b.所有活疫苗组（含二价 prime-only）和灭活疫苗组：几乎完全检测不到病毒排出，组织内也不见病毒复制。

尤其值得一提的是：仅靠 1 次气溶胶首免的二价活疫苗，就能对同源 H9N2 实现“几乎灭菌性保护”。

2. 漂移 H9N2 攻毒：活疫苗明显胜过灭活疫苗
a.二价活疫苗（无论 prime only 还是 prime-boost）：

咽拭子排毒量显著低于未免疫对照；很多时间点上完全检测不到病毒；组织病毒滴度也处于检测下限以下，表现为强烈保护。

b.单价 H9 活疫苗：大部分鸡表现良好，但仍有少数个体在泄殖腔或组织中检出低水平病毒

c.灭活疫苗组：对漂移株的控制明显不如活疫苗，部分时间点咽拭子排毒水平接近对照组；组织中也能检测到较高滴度的病毒。

简单说：在抗原漂移的 H9N2 面前，二价 MLV 的保护广度显著优于传统灭活疫苗。


图4. 二价MLV减毒活疫苗免疫可对同源及抗原发生漂移的H9N2攻毒提供强有力的保护。
五、对高致病性 H5N1：几乎没有 H5 抗体，却挡住了致死攻击？
H5N1 攻毒部分，可以看作是对“隐形保护”的一次严苛检验。

1、先确定攻击剂量：50 个 LD50，研究者先用同一 H5N1 毒株做了 LD50 试验：
a.105 EID50：全部鸡 2 天内死亡；

b.104EID50：全部鸡 5 天内死亡，并伴有典型严重临床症状；

c.102–103 EID50：鸡群基本无临床表现和死亡。

最终计算出 LD50，确定在正式攻毒中使用 50 × LD50 的高剂量，对受试疫苗提出极高要求。

2、生存率：二价活疫苗 prime-boost 达到 90% 存活
在 28 日龄（首免后 28 天 / 强化后 14 天），各组鸡接受 50 LD?? H5N1 攻毒：

a.未免疫对照：全部死亡，平均死亡时间约 43.2 h；

b.单价 H9 活疫苗：同样全部死亡，只是平均死亡时间略有延长（约 57.6 h），提示：只有极其有限的异源保护；

c.二价活疫苗 prime-only：存活率约 30%，其余死亡时间略有延后；

d.二价活疫苗 prime-boost：90% 鸡存活，仅 1 只死亡；大部分鸡无明显临床症状；

e.灭活 H9N2/H5N2 油苗 prime-boost：100% 存活，临床表现安静。

从生存结果来看，二价活疫苗 prime-boost 已经十分接近灭活疫苗的防病效果，而考虑到其更低的劳动成本、更好的黏膜免疫优势，在实际应用中非常有吸引力。


图5. 针对H5的低抗体滴度在H5N1攻毒后仍能提供保护。
3、病毒排毒：二价活疫苗 prime-boost 甚至优于灭活疫苗
再看攻毒后的病毒排出及组织病毒滴度：

a.在咽拭子和泄殖腔拭子中：二价活疫苗 prime-boost 组的排毒量和排毒阳性鸡只数量 普遍低于其他所有组，包括灭活疫苗组；只有 2 只鸡在某些时间点检出低水平病毒；

b.组织滴度（攻毒后第 3 天取样）：仅在二价活疫苗组和灭活疫苗组中各发现 1 只鸡的鼻窦中检出 H5N1；总体来看，二价活疫苗 prime-boost 组在“阻断病毒复制、减少环境排毒”方面表现非常突出。

这意味着：灭活疫苗在“保命”方面略胜一筹（100% vs 90% 存活），但二价活疫苗 prime-boost 更有利于减少病毒排出，对群体防控和减缓病毒进化更有意义。


图6. H5N1攻毒后的病毒载量表明，二价MLV减毒活疫苗首免-强化免疫组获得了保护。
六、几乎没有 H5 HI 抗体，保护从哪儿来？
一个看似“矛盾”的现象是：二价活疫苗组的 H5 HI 和中和抗体基本检测不到；却在 H5N1 高剂量攻毒中实现了 90% 存活和极低的排毒。

作者给出的可能解释包括：

1、NA 抗体的保护作用

虽然 H5N1 携带的是 N1，但实验显示高滴度的 N2 抗体对 N1 几乎不交叉；因此 NA 抗体更可能解释 H9N2 漂移株的交叉保护，而不是 H5N1 的防护。

2、H9 与 H5 之间 HA 柄部（stalk）共享表位

H9 与 H5 同属 I 型 HA，HA 柄区可能存在保守表位；活疫苗在复制过程中，可能诱导了针对 HA 柄部的交叉反应性抗体，虽然这些抗体难以通过传统 HI 检出，却能在体内发挥明显保护。

3、活疫苗激活的黏膜免疫和细胞免疫

MLV 在呼吸道局部复制，有利于诱导 IgA、组织驻留 T 细胞、NK 细胞等多种效应；加入 IL-18 这一免疫因子，又进一步推动 Th1 / IFN-γ 相关的细胞免疫；这些因素叠加起来，可能让鸡在面对 H5N1 攻击时，依靠“非经典中和途径”迅速限制病毒复制。

从防控策略角度看，这也提醒我们：评估疫苗效果不能只盯着 HI 滴度，尤其是对于活疫苗和异源保护，更需要结合病毒排毒、生存率、细胞免疫等多维指标。
七、对养禽业和防控实践的启示
综合来看，这项工作至少带来几方面值得关注的启示：

1、活疫苗 + 气溶胶/饮水，是极具潜力的“群体免疫工具”。免疫方式与行业常规（喷雾、饮水）高度契合；能在短时间内覆盖大量鸡群，降低人工成本和操作应激。

2、基因重排 MLV 的安全性和 DIVA 潜力得到进一步验证。不易与野毒重配，也不易在群体中传播；通过 NA 抗体谱、甚至未来基于 Ta2A 标记的检测，有望实现精准 DIVA 监测。

3、在抗原漂移和异源攻击面前，MLV 的保护广度尤为亮眼。对漂移 H9N2 实现几乎“灭菌性”保护；对 H5N1 高剂量攻毒，结合 prime-boost 程序可达到 90% 存活和最低病毒排出。

4、应用时仍需搭配严密监测和综合防控。单独使用 H9 单价疫苗对 H5N1 攻毒只带来“延迟死亡”，这类“半吊子保护”可能反而促使病毒演化；因此任何疫苗策略都应纳入整体的监测、扑杀、隔离和生物安全体系中使用。
结语
在高致病性 H5N1 持续全球扩散、H9N2 长期地方化流行的大背景下，Faccin 团队提出的这套 “二价 H9N2/H5N2 活疫苗 + 气溶胶首免 + 饮水强化” 方案，为家禽业提供了一条兼顾 效力、安全性、操作便利性和 DIVA 监测 的新路径。

对于养禽企业、疫苗企业以及一线防疫人员来说，未来如果能在大规模实地条件下进一步验证并优化这一技术，也许我们距离“既能保生产，又能控疫情”的理想防控格局，就又近了一步。

来源：poultry times，PT