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禽流感实验室检测技术方案
一、实验室网络设置
实验室网络由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心和省级流感实验室两级组成。
二、实验室条件及生物安全操作的要求
1．省级流感实验室实验条件及生物安全的操作要求
（1）实验生物安全要求：安全Ⅱ级+（BSL-2级+）或安全Ⅲ级（BSL-3级）。
（2）特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测、血清学检测中用到的血凝抑制实验（HI）可以在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室里操作。
（3）特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室的生物安全柜里提取病毒的核酸，进行病毒核酸检测的实验室要求请参照国家有关核酸检测要求的规定。
（4）微量中和实验、特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离、尸检标本的检测必须在安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。
（5）省级流感实验室实验条件：具备进行禽流感相关临床标本初筛所需的生物安全柜、离心机、PCR仪、电泳仪、紫外线检测仪等配套设备。
2．国家流感中心
实验生物安全要求：生物安全Ⅱ级+（BSL-2级+）和生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室。
3．省级流感实验室职责
（1）禽流感标本特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测；
（2）禽流感H5的血清学检测工作;
（3）特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离必须在生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室；
（4）没有生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室的，将标本送国家流感中心做病毒的分离工作。
4．国家流感中心实验室职责
（1）国家流感中心设立在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感室；
（2）对各省报告的禽流感疑似病例或确诊病例进行复核、确认；
（3）对不具备禽流感病毒分离条件的省份送检标本的检测、分离和确认；
（4）对需要做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验；
（5）对各省级实验室检测人员的培训；
（6）对各省级流感实验室的质量控制。
三、原始标本采集
1．标本采集人员
医疗机构的医生、护士或当地疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照《禽流感职业暴露人员防护指导原则》做好个人防护。
2．标本采集种类和时限
（1）采集标本的种类：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。
（2） 采集标本时间：
1）咽、鼻拭子或含漱液在发病的头3天采集；
2）急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集；
3）尸检标本尸检时采集。
3．标本的运送：所有采集的标本应在医院采集时立即分装，一式二份，其中一份单独保存，以备复核。采集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在－70 ℃以下保存。无－70 ℃条件的需在－20 ℃冰箱短时间暂存，并尽快联系递送标本。
4．标本采集的方法：详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》
四、送流感中心的标本包装、运送与接收
1．标本的包装
（1）标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。
（2）将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。
（3）直接在塑料管上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、姓名，同时也将标本有关信息填在禽流感人体标本送检登记表，连同塑料管用另一塑料袋密封。
（4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。若将进行病毒分离，可将密封好的装有标本的容器直接放入液氮运输罐内运输。所有容器必须印有生物危险标识。
2．标本运送
（1）航空或铁路运送。
（2）专人专车运送：主要用于近距离样品运送。
3．标本的接收
（1）各省级中心实验室应公布标本接收联系方式，并实行24小时标本接收制；
（2）国家实验室标本接收：
需送国家流感中心实验室检测的原始标本、病毒分离物、可疑阳性标本、血清等，填写标本送检登记表，在低温保存条件下，于24小时内送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核。国家流感中心标本接收联系方式为：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，地址：北京市宣武区迎新街100号，联系人：郭元吉、王敏，联系电话：010-63534632，010-63581337，传真：（010）63534632。
五、标本检测方法
1．禽H5病毒核酸检测：
材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。
方法： RT-PCR，用于禽H5亚型流感病毒的快速检测、测序及排除工作
试剂：特异性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA 提取试剂盒、逆转录酶、Taq DNA聚合酶等试剂, 建议使用德国QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取 ) 和QIAquick Gel Extraction Kit（PCR产物纯化）产品。
2．病毒分离及鉴定：
材料: 疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。
方法：采用鸡胚和MDCK细胞分离方法，血凝及血凝抑制试验（HAI）具体方法详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》。经特异性H5 RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离及鉴定工作必须在安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。
试剂：鸡胚接种采用SPF鸡胚，MDCK细胞等。
3．疑似病例的血清学检测：
材料：疑似病例的急性期和恢复期的双份血清
方法：血凝抑制实验具体方法详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》。
试剂：H5灭活病毒。
4．微量中和试验
材料：疑似病例的急性期和恢复期的双份血清
试剂：H5活病毒，必须在生物安全Ⅲ级 (BSL-3级)实验室里操作。
六、检测结果的确认
以下情况的原始标本及分离物送国家流感中心检测、复核、确认。
1．标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5血凝抑制试验（HI）阴性，H5的RT-PCR检测阳性。
2．标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5血凝抑制试验（HI）阳性或H5的RT-PCR检测阳性。
3．标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5的RT-PCR检测阳性。
4．病人恢复期血清比急性期血清的H5抗体有4倍或以上增高。
5．标本分离物血凝试验（HA）阳性，H5血凝抑制试验阴性，并已排除了是当前流行的甲、乙型毒株的可能。
七、检测结果报告
一般情况下, 实验室收到的样本立即进行实验，并于收到标本后24小时内出具RT-PCR检测报告，3-5天出具病毒分离培养结果，于分离到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制结果，微量中和实验须3-5天完成。
当实验过程中出现不可预测情况或意外事件，影响了按时出具报告时，应及时报告和说明。
附件
ICS
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作者：悠然
发表时间：2006-2-18 14:32:46
中华人民共和国国家标准
GB
流行性感冒诊断标准及处理原则
Diagnostic criteria and principles of management of influenza
(报 批 稿)
发布 实施
国家质量技术监督局发布
目 次
前言――――――――――――――――――――――――――――――――3
1 范围―――――――――――――――――――――――――――――――4
2 诊断原则―――――――――――――――――――――――――――――4
3 诊断标准―――――――――――――――――――――――――――――4
4 处理原则―――――――――――――――――――――――――――――5
附录A （规范附录） 病原学诊断方法―――――――――――――――――5
附录B（规范附录） 血清学诊断方法―――――――――――――――――7
附录C（资料附录） 红细胞凝集抑制试验―――――――――――――――8
附录D（资料附录）神经氨酸酶活性抑制试验――――――――――――――12
附录E（资料附录） 对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验―――――――――16
附录F（资料附录） 流感快速诊断方法――――――――――――――――19
GB
前 言
流行性感冒(简称流感)为一种人、禽、畜共患的病毒性急性传染病。流感病毒根据其核蛋白（NP）和M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒能引起流感局部暴发，不会造成世界性流感大流行，至今除在人以外还能在海豹中分离到它。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，它也能感染猪。流感常突然发生，迅速蔓延，波及面广，发病率和死亡率均高但病死率低。至今仍严重威胁着人的身心健康，甚至夺走性命，常给国民经济带来巨大损失，我国被世界公认为是流感的多发地。
受卫生部传染病防治监督管理办公室委托，由郭元吉同志负责对流行性感冒诊断标准及处理原则GB15944-1995进行修改，其目的：把过时的，不适用的删除，加入适用新的内容。具体修改之处如下：
1．前言中强调了流感为一种人、禽、畜共患病，同时考虑到禽流感病毒在人群中可引起的流感，其传播途径不清楚，故把传播途径删除。
2．诊断原则中增加了或从患者采集的标本中查到病毒颗粒特异的蛋白或特异核酸成分。
3．实验室诊断中去掉白细胞计数指标，因该指标不能做为流感的试验诊断依据。
4．附录A。病毒分离中，因甲型流感病毒“O”相特性的出现，故强调了细胞系统分离病毒的重要性；在HA测定中不应用鸡红细胞，而应用豚鼠或人的红细胞。
5．把B3神经氨酸酶抑制试验改为附录D。把B3中不规范的一律改为当今国际上统一使用的方法。
6．删除B2已过时，操作复杂，易受实验条件影响的“型特异性补体结合试验，改为附录E“对流免疫电泳”，同时考虑到对禽血清抗体测定时，常用琼脂凝胶沉淀试验。因此，在附录E中也加入后者的内容。
7．快速诊断为附录C改为附录F。同时加入FLU OIA Kit 和RT-PCR法。
本标准的附录A和B是规范的附录。
本标准的附录C-F是资料的附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
本标准主要修订人：郭元吉
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。
中华人民共和国国家标准
流行性感冒诊断标准及处理原则 GB
Diagnostic criteria and principles of management of influenza
1 范围
本标准规定了流感的诊断标准及处理原则。
本标准适用于各级医疗、卫生、保健机构和人员。
对流感的诊断，报告和处理的应用。
2 诊断原则
流感流行时一般可根据临床症状，结合流行病学资料可对患者作出初步诊断。如确诊则需要病毒分离阳性或病人双份血清抗体测定，其恢复期抗体滴度较急性期增高4倍或以上，或从患者采集的标本中查到病毒粒特异的蛋白或特异核酸成分。
3 诊断标准
3．1 流行病学资料
在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内本地区或邻近地区上呼吸道感染病人明显增多；或医院门诊呼吸道感染病人明显增多；或挨家挨户上呼吸道感染患者明显增多。
3．2 临床症状
3．2．1 出现急起畏寒、高热、头痛、头晕、浑身酸痛、乏力等中毒症状。
3．2．2 可伴有咽痛、干咳、流鼻涕等症状。
3．2．3 少数病例有食欲减退、伴有腹痛，腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。
3．3 实验室诊断
3．3．1 从病人鼻咽分泌物中可分离到流感病毒（见附录A）。
3．3．2 患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍或以上（见附录B）。
3．3．3 在患者呼吸道上皮细胞查到流感病毒颗粒特异的蛋白成份或特异的核酸（见附录F）。
3．3．4 采集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，查到流感病毒粒特异的蛋白或特异的核酸（见附录F）。
3．4 病例分类
3．4．1 疑似病例（流感样病例）
具备腋下体温≥38℃，加上其他临床症状两项或以上，或加3、1及胃肠道症状两项或以上。
3．4．2 确诊病例
疑似病例加3.3.1或3.3.2或3.3.3或3.3.4。
4.处理原则
4.1 早期隔离病人,服抗流感病毒药物,对症治疗和防并发症.
早期发现病人,早期隔离(因地制宜,就地适当隔离)病人是重要的措施.对病人治疗一般采用对症疗法,发病早期(48小时内)可服用抗流感病毒药物,严重患者如严重肺炎,呼吸极度困难,高热不退等需住院治疗.防治并发症主要应防止流感病毒性肺炎和细菌性肺炎,尤其对年迈体衰者或伴有心血管,糖尿病,慢性呼吸道疾病者或婴幼儿等流感高危人群因他们由于流感本身或其它合并症可造成死亡,故应特别注意加强治疗护理.
4．2 预防措施
一般采用综合性措施，讲究卫生，注意体格锻炼和营养，保持室内空气流通；对易感人群应采取相对隔离措施，如避免接触病人，不去公共场所等；对年迈和健康状态差，尤其带有慢性病的人必要时可采用灭活疫苗接种，对疫苗过敏者或可能已被感染（如密切接触病人）者应及时服用抗流感病毒药物。
附录A
（规范附录）
病原学诊断方法
A1 病毒分离
从疑似流感病人呼吸道采集标本分离病原体．
A2 标本的采集
病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，时间（应于发病的头3天，越早越好），及其保存运输等环节。
标本主要取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。
常用的采样液为：普通肉汤，pH 7.4-7.6的Hanks氏液或Eagle氏液或水解乳蛋白液。在采样液中需加入抗菌素，以往多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ ml）和抗真菌素（终浓度为每ml采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。
A2．1 标本采集方法
A 2．2．1 鼻拭子
将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去。然后，塞紧或盖好管盖。
A2．2．2 咽拭子
用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去，塞紧或盖好管盖。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作 量。
A2．2．3 鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物
用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从 气管抽取气管和支气管分泌物。
先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。近来国内有用小孩导尿管接在50 ml注射器上来替代收集器。
A2．2．4 漱口液
用10 ml采样液漱口。漱时让患者头部微后仰，发噢声，让洗液在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集漱液。
注：取漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有，含漱液中不应含抗菌素。
A2．2．5 肺活检材料
肺活检组织在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入上述提到的抗菌素。
A3 标本运送
标本应在≤4℃条件下，尽快送至实验室。标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种可置4℃保存，如未能接种应置≤-70℃下保存。
A4 标本处理
标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。然后用干净灭过菌的毛细吸管反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液。置4℃待其自然沉淀5-10min。
注：如采样液中尚未加抗菌素应补加之，所加的量同前，加完并混匀，置4℃ 1-2h后方可用于接种。
A5 接种与培养
最常用的为细胞接种和鸡胚接种法，有条件的应两法并用。近来由于“O”相毒株的出现，MDCK（Madin Dardy Canine Kidney）等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。同时“O”相毒株几乎不凝集鸡红细胞，故近来在红细胞凝集和凝集抑制试验中常用豚鼠或人的“O”型红细胞，而不用鸡的红细胞。
A5．1 MDCK细胞接种和收获
成片的MDCK细胞弃生长液，用Hanks氏液洗两遍，将残余的牛血清洗净，每瓶加入接种标本0.5-1.0 ml，（接种量要根据瓶的大小），一般2瓶/标本，轻晃细胞瓶，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附1-2h；倒掉感染液，再用Hanks氏液洗1-2遍，每瓶加入3 ml（随瓶的大小而异）维持液（不含小牛血清，而含终浓度为2ug/ml胰酶的Eagle氏溶液），置35℃培养；次曰起每天观察有无细胞病理变化（CPE）；当CPE出现+++ ～ ++++号时，即75%-100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可将细胞冻融1-2次以提高收获标本的病毒滴度。由于CPE不能证实就是流感病毒所造成。最后还需检查维持液中是否有红细胞凝集活性（HA），用毛细吸管取细胞维持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞，轻摇混匀，置室温或4℃，1h后观察结果。出现红细胞凝集的为阳性标本，收获所有的维持液进行病毒鉴定。
如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞中传代，把HA滴度提高或量增加后，方可进行病毒鉴定。
如HA阴性，应在MDCK细胞上盲传一代，如HA仍阴性，可认为是阴性标本，弃之。
注： CPE出现时间随感染病毒的型别，甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。一般标本接种后7-10天还不出CPE，维持液中又查不出HA活性，基本上可认为阴性标本，弃之。同时要注意MDCK细胞的代数，因随MDCK细胞代数增加，其对流感病毒的敏感性下降。
A5．2 鸡胚接种和收获
取9-11曰胚龄鸡胚，经羊膜腔和尿囊腔接种标本0.2 ml，每份标本接种3-4只胚，置33-35℃培养72h。然后将鸡胚置4℃过夜（或置-20℃冰箱1h再置4℃数小时），分别收获尿囊液和羊水并检查HA活性（用毛细吸管分别取3-4滴尿囊液和羊水，分别置大孔塑料板不同孔内，再加入3-4滴1 %豚鼠或人红细胞，摇匀后置室温或4℃ 1h后观察结果。如HA为+++ ～ ++++时，再按系列倍比稀释测定HA滴度，如具有一定的HA滴度即可进行病毒鉴定。如HA阴性，可盲传一代，如HA仍为阴性则弃之。
A6 病毒鉴定
至今对流感病毒鉴定最常用的方法为红细胞凝集抑制（HI）测定，因该法简便易行，结果可信（具体方法见附录C）。其次为神经氨酸酶活性抑制（NI）测定（具体方法见附录D）。进行型鉴定时常用对流免疫电泳（具体方法见附录E）。
附录B
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作者：悠然
发表时间：2006-2-18 14:34:31
血清学诊断方法
B1 血清标本采集
血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，一般不晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2-4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。
B2 血清标本运送和保存
血清标本在4℃下运送，置≤-20℃下长期保存。
B3 抗体测定
测定用抗原一般为当前人群中流行的H3N2 和H1N1亚型及乙型流感病毒。测定方法为HI法（见附录C）。
B4 结果判断
凡恢复期血清抗体滴度比急性期增高≥4倍为阳性结果，其余的均为阴性结果。
附录C
（资料附录）
红细胞凝集抑制试验
C1原理
流感病毒粒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能够与一些哺乳类动物和禽的红细胞发生凝集，这就是红细胞凝集现象。
虽然多种哺乳动物和禽类的红细胞均能被流感病毒凝集，但目前应用最广的是豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。
“O”相毒株是指只能在鸡胚羊膜腔或敏感细胞中生长，感染的羊水或细胞维持液只凝集人或豚鼠的红细胞，而几乎不凝集鸡的红细胞的流感毒株。这种毒株在鸡胚尿囊腔适应传代后，获得了在鸡胚尿囊腔复制的能力，同时还获得了对鸡红细胞凝集能力与人及豚鼠的一样好，这种生物学特性发生改变的病毒为“D”相毒株。
流感病毒能从凝集的红细胞表面释放下来，释放下来的病毒还能凝集新的红细胞，而被凝集和释放后的红细胞不能再被相同的病毒颗粒所凝集。
于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制实验。
目前，红细胞凝集和凝集抑制实验为流感各方面工作中应用最广泛的一种技术。
C2实验器材
C2．1 大孔或小孔塑料板
C2．2 10ml或1ml 或1000ul和200ul或多排吸管
C2．3 200ul和1000ul吸头
C3试剂
C3．1 0.85% 无菌生理盐水
C3．2 Alsever氏液
葡萄糖 2.08g
柠檬酸钠 0.80 g
柠檬酸 0.055 g
NaCl 0 .42g
加蒸馏水至 100ml
8磅20分钟高压灭菌，置4℃备用。
C3．3 1% 红细胞悬液
以鸡红细胞为例：于10或20ml注射器中先吸入约3 ml 阿氏液（Alsever's Solution），然后从鸡翅静脉或心脏采集，用生理盐水洗涤3次，前2次1500r/ min离心5min，最后1次同速度离心10min， 弃上清，用无菌生理盐水配成1%悬液，置4℃待用。一般置4℃能保存7天左右，一旦发生溶血应弃掉。
C3．4受体破坏酶（RDE）
C3．5 免疫血清或测定血清
C4红细胞凝集实验
C4．1 操作步骤
C4．1．1 取一干净的大孔塑料板，标记所要测定的标本名称
C4．1．2 于第一孔加入0.25ml（1：2开始稀释）或0.4ml（1：5开始稀释），从第二孔开始一律各加0.25ml 0.85%生理盐水。
C4．1．3 如1：2开始稀释，于第一孔中加入0.25ml病毒悬液；如1：5开始稀释，于第一孔中加入0.1ml病毒悬液。用吸管吹打，使充分混匀，吸出0.25ml至第二孔，依次类推作倍比稀释，直至最后一孔，吹打后吸出0.25ml弃掉。
C4．1．4 于每孔中加入0.25ml 生理盐水，然后再加入0.25ml 1% 红细胞悬液。相混后置室温或4℃ 30-60min，而后观察结果。
注：如采用微量法，应用小孔塑料板和稀释枪，总量为75ul（病毒25ul，25ul生理盐水和红细胞悬液25ul），其余同常量法。
C4．2 观察结果
结果以++++、+++、++、+、±和— 表示之。
一层红细胞均匀地铺于孔上者为++++。
基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。
红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++。
红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。
红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为 — 。但用豚鼠或人“O”型红细胞时常见不到孔底形成一个小团和眼泪滴样结果出现。
“±”即为可疑，计算时以“—”（阴性）处理。
C4．3 红细胞凝集滴度计算
结果以++为终点，亦即一个凝集单位。也就是说最高稀释度病毒能引起++号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称血凝滴度。
下面以表1为例，进行计算。
表１ 红细胞凝集单位计算
标本号 病毒稀释度 滴度 备注
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280
1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ — — 480 取均数
2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + — 560 小1/8
3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ — 640 不必算
4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ — 800 大1/4
5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ — 640 显畸后算
6 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ >1280或≥1920
7 — — — — — — — — <10或≤7.5
口诀：
1． 显畸后算。表1中，1-4，6和7不必进行整理，而5中，必须将1：640处一个加号挪到1：320处为4个加号，而1：160处变成两个加号，然后再进行计算。
2． 两个加号不用算。如表1中的3，滴度为640。
3． 小，小本身的1/8。如表1中的2，1：640处仅一个加号，故血凝滴度一定小于640，应为640-640/8=560。
4． 大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，应为640+640/4=800。
5． 两个极端取中间。如1，1：320为4个加号，1：640为阴性，应为（320+640）/2=480。
C5红细胞凝集抑制实验
C5．1操作步骤
C5．1．1 血清中非特异抑制素的去除
受体破坏酶（RDE）处理法：1容量血清，加4容量RDE，37℃水浴16~18h，然后，置56℃水浴50min(以破坏残余的RDE活性)；置4℃保存待用，勿冻存。经此法处理的人、鸡和山羊血清对甲、乙型流感病毒的非特异性抑制素均可完全去除。RDE处理对特异性抗体无影响。但有时经处理的血清对测定的红细胞有非特异性凝集。如发现时应在处理后血清中加入终浓度为20%的浓的测定用红细胞，摇匀，置室温60min或4℃过夜，1000r/min离心5min，收存上清。对人血清抗体测定时，一般均经此步处理。
C5．1．2 四个血凝单位抗原的制备
四个血凝单位计算：将血凝单位除以4，如表1中标本1，它的四个血凝单位应为：480/4=120，即将标本1进行1：120稀释时，其稀释液就是含四个血凝单位。配成后必须进行复核测定：取一块干净的大孔塑料板，在前三孔，也可任意连续的三孔，每孔加入0.25ml生理盐水，用一根1ml的吸管，取0.25ml四个血凝单位的抗原放入第一孔，倍比稀释至第三孔，吸出0.25ml弃之，然后每孔加入0.25 ml生理盐水，再加入0.25ml 1%红细胞悬液，摇匀，置室温30—60 min后，观察结果。正确结果，应第一孔出现++++，第二孔++，第三孔阴性或+。如太大或太小都得重新配置。复核测定合格后，置4℃或冰上，当天使用。
C5．1．3 血抑测定
C5．1．3．1 取一干净的塑料板，标明测定血清标本，最后一孔为血清对照孔。
C5．1．3．2 每孔加入0.25ml生理盐水。
C5．1．3．3 于第一孔和最后一孔中各加入0.25 ml经RDE处理过的血清，从第一孔起作倍比稀释至倒数第二孔，弃掉0.25ml。
C5．1．3．4 将最后一孔轻轻吹打后，亦弃掉0.25ml。
C5．1．3．5 于最后一孔加入0.25ml生理盐水，其余各孔一律加入0.25ml四个凝集单位抗原，轻轻摇匀，置室温60 min。
C5．1．3．6 各孔加入0.25ml 1%的红细胞悬液，摇匀置室温30-60 min后观察结果。
C5．1．3．7 对照组
血清对照 血清0.25ml+生理盐水0.25ml
血凝素对照 分别加入4，2，1，1/2单位血凝素0.25ml+生理盐水0..25ml
红细胞对照 加生理盐水0.5ml
以上各对照组再分别加入1%的红细胞悬液0.25ml，摇匀，在同等条件下观察结果。
C5．2 结果判断
血凝的记录同血凝测定法，以能完全抑制红细胞凝集（简称血抑）的最高血清稀释度的倒数为血清抗体效价，即终点。以表2为例，加以说明。
表2 血抑测定结果
血清号 血清稀释度 效价
1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280
1 — — — — — — ++++ ++++ 320
2 — — — — — + ++++ ++++ 280
3 — — — — — ++ ++++ ++++ 240
4 — — — — — +++ ++++ ++++ 200
5 — — — — — ++++ ++++ ++++ 160
6 — — — — — + +++ ++++ 320
7 — — — — — — — — ≥1280
8 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ <10或≤5
同样在计算抗体效价之前，应对结果进行整理，方法同前。如6中，必须把1：320处的一个加号移到1：640处，使1：320处变成“—”，而1：640处变成“++++”。
根据公式进行计算： X=Y+Y/4×Z
X：血清效价
Y：能引起血凝全抑制最高血清稀释度的倒数
Z：4减去不能被抑制数（全抑制高一个稀释度）
例如：2号血清效价：X=Y+Y/4×Z=160+160/4×（4-1）=280
C5．3 交叉血抑测定和抗原比计算
为了确切了解抗原性变异的幅度，常用交叉血抑测定进行抗原分析。测定中所用的免疫血清包括既往流行过的代表株和用新分离病毒制备的免疫血清。所用抗原都是和血清相应的同株抗原。每个抗原均必须准确调至四个单位，实验必须在同一条件下进行。
根据公式计算抗原比： R=√r1•;r2
r1=甲血清对乙抗原的血抑滴度/甲血清对甲抗原的血抑滴度
r2=乙血清对甲抗原的血抑滴度/乙血清对乙抗原的血抑滴度
R为抗原比，当R=1时，表明两株间抗原性相同；R<1.5/1或1/<1.5时，表明两毒株间抗原性无明显差异；R为1/1.5—1/2时表明两毒株的抗原性有小差异，R值越大，差异越大。
录D
（资料附录）
神经氨酸酶活性抑制试验
D1反应原理：
D1．1 自由的N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid）经神经氨酸酶的作用，自胎球蛋白（Fetuin）底物中释放。
D1．2 经过碘酸盐的氧化作用，将N-乙酰神经氨酸转化为ß;-甲酰丙酮酸（β-formyl pyruvic acid） 。
D1．3 ß;-甲酰丙酮酸经硫代巴比妥酸的作用形成生色团。
D1．4 用有机溶剂提取生色团，便可用分光光度计测定之，这样可测知标本中神经氨酸酶活性，并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。
神经氨酸酶活性抑制实验是测定血清抑制标准量酶活性的效价。
NI测定已成为流感病毒鉴定不可缺少的手段之一。因NI测定结果是流感病毒神经氨酸亚型划分的主要依据之一。有时该法也用于了解流感病毒NA抗原性变异和血清诊断等方面。NI测定不受血清中非特异性抑制素的影响，但易受病毒粒血凝素抗体的影响即空间干扰。为解决这弊端，在流感病毒鉴定中，常使用单价血清（只针对NA的）或基因重配毒株所制备的免疫血清（如使基因重配株NA抗原为N2或N1，其HA抗原为马1（H7）亚型的）。
D2 材料
D2．1 试剂配制
D2．1．1 磷酸缓冲液
甲液：400mmol/L 正磷酸氢二钠
乙液：400mmol/L 正磷酸二氢钠
丙液：60 mmol/L 氯化钙
甲液19 ml加乙液81 ml混之，将pH调至5.9±0.05，pH偏高用乙液调之，偏低用甲液调之。而后加入1 ml丙液，此时CaCl2的终浓度为6 mmol/L。置4℃或室温保存。
注：常常加入CaCl2后，缓冲液出现沉淀，故我们一般不加它。甲、乙液为200 mmol/L。
D2．1．2 胎球蛋白
用蒸馏水把冰冻干燥的胎球蛋白配制成48-50mg/ml的溶液（让其缓慢溶解）。或将冰冻保存的胎球蛋白溶液用去离子水配成工作液。
D2．1．3 过碘酸盐试剂
4．28g过碘酸钠(NaIO4)溶于38ml去离子水中，加62 ml浓正磷酸，充分混合，存于带玻璃塞的棕色瓶中。
D2．1．4 砷试剂
10 g亚砷酸钠（NaAsO4）和7.1 g无水硫酸钠加去离子水至100 ml，混之，加0.3 ml浓硫酸，使之完全溶解。
D2．1．5 硫代巴比妥酸试剂
1.2 g硫代巴比妥酸和14.2 g无水硫酸钠加入去离子水至200 ml，在沸水浴中加热溶解，用前新配，使用期为一周。
D2．1．6 生理盐水
0.85g NaCl加入100 ml去离子水，溶解，置室温保存。
D2．1．7酸化正丁醇试剂
95ml正丁醇（Butanol）中加入5ml浓盐酸，存在带塞棕色瓶中置室温保存。
D2．1．8 玻璃器材和煮锅等。
D3 操作步骤
D3．1 神经氨酸酶活性测定
D3．1．1 病毒溶液用生理盐水作倍比稀释，一般新鲜尿囊液抗原作1：2—1：32稀释已足够。稀释好的病毒，每个稀释度加一管，0.05ml/管。于底物对照管中加入0.05ml生理盐水(不加病毒)。
D3．1．2 于每管中加入0.05ml pH5.9的PBS(因流感病毒神经氨酸酶最适pH为5.9),每管中再加入0.1 ml胎蛋白溶液,充分混合后置37℃水浴16-18h。
注:加每样试剂均应送至管底;我们稀释病毒有时直接用200 mmol/L pH5.9的PBS,每管加0.1ml,这样做不正规,但操作方便，对测定结果影响不大;有些流感病毒株NA活性很高，于37℃水浴2-4h(与底物一起)就可测出酶活性.
D3．1．3 从水浴中取出试管，放室温冷却，每管加入0.1ml过碘酸盐试剂，充分混合，置室温20 min（这个时间要精确）。
D3．1．4 每管缓慢加入1ml砷试剂。由于碘的释放出现棕色，摇荡试管待棕色消失乳白色出现为止。必要时试验可在此步暂停，测定物置4℃冰箱保存。其余测定步骤一律不能暂停）。
D3．1．5 每管加入2.5ml硫代巴比妥酸试剂，充分混合。该试剂在煮沸溶解时趁热加入管中。
D3．1．6 立刻将试管置煮沸的水浴中煮15min，此时所出现的红色即为神经氨酸酶活性的反应。
D3．1．7 将试管置冰水中冷却，然后加入4ml酸化正丁醇，塞上干净的胶皮塞，用手剧烈摇荡1-2min，使红色转到丁醇层。
D3．1．8 1500r/min离心5min,上层达到透明不混浊。
D3．1．9 将分光光度计波长调至549nm，用底物对照管调零点，而后，从高稀释度到低稀释度，将管中的上层溶液吸置透光池中，依次测出并记录它们的吸光度A值（曾称光密度OD值），A值越高表明酶活性越强。
D3．1．10 一个酶单位确定：一般将A值为0.45-0.85的病毒稀释度作为一个酶单位。我们常将A值为0.5的病毒稀释度为一个酶单位，用于酶活性抑制测定。一个酶单位确定方法如下：将上述测到的数据作直线回归，找出A值为0.5的病毒稀释度。但也可以下方法来确定：
（1） 取一张半对数坐标纸，其纵轴（对数）表示病毒的稀释度，横轴（算术）表示吸光度。于吸光度值为0.5处画一条与纵轴平行的直线。
（2） 将所得的A值一一标在相应的位置上，见图1示意图。
（3） 在吸光值0.5附近找出4个点，其中2个点A值大于0.5，而另2个点小于0.5。在这4个点中找出一条直线，这条直线要使它一侧点至其垂直线的平均值与另一侧点到其垂直线的平均值相等。这条线与0.5的垂直线有一个交叉点（图中X点）。
（4） 从X点向纵轴线划一条与横坐标相平行的线（图中虚线），这条线与纵坐标相交的点为Y。
（5） Y点所示的数字如8，也就是说当测定病毒1：8稀释时就相当于一个酶单位。
注：由于病毒鉴定时多为定性，一般做到步骤6（D3.1.6）已足够，接着可凭经验判断病毒所用的浓度；有些流感病毒株酶活性很低，经延长与底物孵育时间后仍很低，对这些毒株进行酶鉴定时，需灵活掌握，一般肉眼见到有一定的红色（吸光度肯定小于0.5）也就可以了。
D3．2 神经氨酸酶活性抑制测定
D3．2．1 测定血清作0.5Lg稀释（一个0.5Lg稀释为1：3.16，它的近似值为1：3.2）。具体稀释法举例如图2。稀释好的血清从高稀释度到低稀释度各取出0.05 ml于标好相应稀释度的空管中.按同法做正常血清对照组。
D3．2．2 将已测定的抗原用生理盐水配成一个酶单位，加入测定血清和对照血清中，0.05 ml/管。相混，37℃水浴孵育1h。
D3．2．3 从水浴中取出试管，每管加入0.1 ml胎球蛋白溶液，混合，置37℃水浴16-18h。
D3．2．4 从水浴取出，接着步骤同酶测定步骤3-9（D3.1.3-D3.1.9）。但吸上层溶液于透光池中，应从低稀释度血清到高稀释度血清。
D3．2．5 计算血清对神经氨酸酶活性抑制效价：根据测定血清与正常血清两组的测定结果，求每组血清同一稀释度A值的商数，即为经血清作用后所剩的酶活性百分数。具体计算公式如下：
每一稀释度（如1：10）血清+病毒的A值
X 100% = %酶活性
同一稀释度（1：10）正常血清+病毒的A值
D3．2．6 血清效价是能抑制50%酶活性的最高血清稀释度的倒数。它的确定方法如下：
（1） 取一张半对数坐标纸，纵坐标（对数）表示血清稀释度，横坐标（算术）表示剩下神经氨酸酶活性的百分数。
（2） 将“5”步骤（D3.2.5）所得的数放在坐标纸上应在的位置。如图3。
（3）从酶活性剩余50%处划一条与纵坐标平行的直线，在50%酶活性处找出3-4个点，使其中1-2个点剩余酶活性不到50%，而其他1-2个点剩余酶活性大于50%，在这3-4个点间画一条直线，同样使这条直线一侧的1-2点至直线垂直线的平均值与另一侧的垂直线平均值相等。
（4）从这条线与50%线相交处（途中x）向纵坐标划一条与横坐标相平行线。这条线与纵坐标相交叉（y）处所表示的数字即为血清效价。如y处为1400，则该血清神经氨酸酶抑制效价为1：1400。当然也可用直线回归来计算。
注：对流感病毒株鉴定时，我们对阳性血清常用200mmol/L pH5.9的PBS进行倍比稀释，一般从1：10开始，用量0.1ml/管，这样加上0.1ml抗原在加0.1ml底物，这时总量为0.3ml/管，与标准的0.2ml/管有出入，但对定性测定影响不大；正常对照血清用不同亚型或不同型免疫血清替代；结果常用肉眼判断，不测A值；至于血凝素抗体空间干扰问题，一般情况不加以重视，因它的干扰程度约为10%，我们所用的免疫血清血抑效价多为1：640左右，这样当NI效价≥40时可判为阳性，一般就不受空间干扰影响了；当然对关键重要毒株鉴定时，需用单价的抗血清进行鉴定；在磷酸缓冲液中需加入终浓度为1‰的NaN3；Russ 等人曾报道用三硝基甲苯X-100（Triton X-100），Yamane等人报道用多聚仙梨醇 （Nonidet P40）直接处理完整的病毒粒，就能排除空间干扰，根据我们的实践，这些方法效果不稳定。
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作者：悠然
发表时间：2006-2-18 14:36:10
对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验
E1 对流免疫电泳 （Counter- Immunoelectrophoresis ）
E1．1 原理
带电颗粒向着与它相反电荷的电极移动，称为“电泳”。胶体颗粒由于解离或吸附而使表面带电荷，在电场中便发生移动。例如蛋白质由于有暴露在表面的极化基团，如-COO- 基和NH3+，在酸性溶液里-COO- 基和H+结合，生成不解离的-COOH，结果蛋白质分子表面的NH3+基过剩，使它带有正电荷；反之，在碱性溶液里，-OH-与-NH3+基作用生成H2O和不带电荷的-NH2基，结果，分子因-COO-基过剩而带负电荷。反应式如下：
NH3+ NH3+
在酸性条件下：蛋白质 +H+ 蛋白质
COO- COOH
NH3+ NH2
在碱性条件下：蛋白质 +OH- 蛋白质 +H2O
COO- COO-
在某一特定pH时，蛋白质分子净电荷为零，这时的pH为该蛋白的等电点。在等电点的pH溶液中，蛋白质分子既不向正极也不向负极移动。根据胶体的此种特性，给一个高于或低于蛋白质等电点的pH溶液，在一定的电场影响下会使颗粒向一极移动。
在pH 8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，它的分子较大，电泳慢，受电渗作用的影响，电泳时向负极倒退。抗原蛋白有较强的负电荷，分子较小，泳动快，在电渗作用下，虽然减慢了泳动的速度，但仍向正极泳动。如将抗体置正极，抗原置负极，电泳时，抗体和抗原相对泳动，一定时间后在两极之间相遇，在适当的地方就形成肉眼可见的沉淀线。
E1．2 主要材料
E1．2．1 甲、乙型流感病毒NP抗原和相应的抗血清。
E1．2．2 pH 8.6巴比妥缓冲液
9g 巴比妥纳加0.5 g NaN3,用去离子水配至1000 ml,而后用盐酸将pH调至8.6。
E1．2．3 1.5%琼脂糖
1.5g琼脂糖加50 ml pH8.6巴比妥缓冲液,用去离子水补至100 ml,相混,溶解。
E1．2．4 玻璃板或特制的电泳框架。
将溶化的琼脂糖倒在玻璃板或框架上，琼脂厚度为2-3 mm。
E1．2．5 染色液
0. 5g考马斯亮兰溶于100 ml去离子水中。但一般不需要染色。
E1．3 操作步骤
E1．3．1 待琼脂糖凝固结实后，打数排小孔，横纵向孔距均为6 mm，孔直径为4 mm。
E1．3．2 放电泳液
把打好孔的板放入电泳槽中，然后放入电泳液（pH8.6巴比妥缓冲液）。但电泳液不能把琼脂淹没。
E1．3．3 搭桥
玻璃板两头（正、负极）用普通滤纸搭成桥，使电泳时电流从琼脂糖通用。
E1．3．4 加样
见下面示意图。
抗体
抗原
抗体
抗原
A为甲型流感病毒；B为乙型流感病毒；“未”为测定的未知抗原
E1．3．5 电泳
一般用低压输出，2mA/cm，电泳1-2h。
E1．3．6 结果观察
首先观察对照样本。A与A，B与B孔间应见清晰的一条白色沉淀线，A与B及B与A孔间见不到白色沉淀线；如果测定抗原与A抗体孔间出现一条白色沉淀线，就判断测定抗原为甲型流感病毒；如果测定抗原与B抗体间出现一条白色沉淀线，则断定测定抗原为乙型流感病毒。
注：有时电泳后，沉淀线不够清晰，可将琼脂板泡在生理盐水中2-4 h；也可将盐水泡过的琼脂板放入考马斯亮兰溶液中染1 h，取出再泡在盐水中，这样能提高沉淀线的清晰度。用盐水浸泡过的沉淀线为白色，而经考马斯亮兰染色过沉淀线为兰色。经染色后仍见不到沉淀线，可判定测定抗原既不是甲型，也不是乙型流感病毒。
E2 琼脂凝胶沉淀试验
琼脂凝胶沉淀（Agar Gel Precipitation，AGP）试验是根据在琼脂介质中抗原和抗体同时向着相互方向移动所形成的沉淀线。所有流感病毒核壳蛋白（NP）和基质蛋白（MP）的抗原性均具有型的特异性。AGP试验就是用来测定上述两种抗体或抗原。而当前主要用于禽血清中的抗体测定。
当今已发现的甲型流感病毒，其血凝素有15个亚型，神经氨酸酶有9个亚型，它们均能在禽中找到，如果用HI或NI法（具有亚型特异的）进行血清学调查，几乎不可能，因工作量很大。众所周知，禽流感实际上为一种人、禽、畜共患病，禽中的流感动态已越来越被人们所重视。
以往认为禽血清的抗体用琼脂凝胶沉淀测定时，不易出现沉淀线。近来发现，如在高盐条件下，可出现清晰的沉淀线。
E2．1 安全
操作酚时戴上手套和面罩，用过的装置和电极用冷水冲洗；如果接触到酚，马上洗手，接触部位立即用冷水冲洗。
E2．2 实验材料
E2．2．1 琼脂扩散板配制：
氯化钠 80g
酚 5g
去离子水 1000ml
琼脂 12.5g
先用去离子水将酚和氯化钠溶解，用1N NAOH将pH调至7.5，然后加入琼脂，煮沸溶解。可按每玻璃瓶20 ml量进行分装，置室温冷却，凝固，而后置4℃保存。用时，再煮沸溶解，倒入陪替氏培养皿，让其凝固。
配制时，可根据需要量按上述配方配之。
E2．2．2 病毒浓缩
含病毒的鸡胚尿囊液或细胞维持液
↓
1000xg 离心 15min，去沉渣
↓
100000 xg 离心 1h，去上清
↓
浓缩时，一般鸡胚尿囊液用500ul，细胞上清为700 ul 。
此时在沉淀物中加入350 ul TSE 溶液，把沉淀物吹匀，收集到1.5ml沉淀管中。
注：病毒浓缩也可用常规的超速离心，甚至可加以纯化，用时可参照上述比例，如500 ul 尿囊液变为350 ul 。
E2．2．3 TSE溶液配制
Tris 2.42g
NaCl 8.77g
EDTA 0.74g
去离子H2O 900ml
溶解后用1N HCl将pH调至7.8，然后用去离子水补至1000ml，消毒或超滤除菌，至4℃保存，待用。
E2．3 实验步骤
E2．3．1 用模具和打孔器，在已凝固的琼脂上打孔，孔径为5mm，孔距为2-5mm。
E2．3．2 每孔加入约50 ul的测定血清，同时需有阳性和阴性血清对照孔。
E2．3．3 将加样后琼脂板放入盒中，封好，置室温下孵育，盒中放一小块湿棉花或湿的滤纸，保持湿度。
E2．3．4 结果观察
24-48h后，观察沉淀线，沉淀线清晰度取决于抗原和抗体的浓度。
沉淀线最好在黑背景下进行观察，而光线是在黑背景后面射出。特异的阳性结果，阳性血清与抗原及测定血清与抗原间呈连续的沉淀线。如出现交叉沉淀线，表明测定血清缺乏与阳性血清一致的抗体。如阳性血清与阳性抗原不出现沉淀线或阴性对照抗血清与阳性抗原出现与阳性对照的孔一样的沉淀线，表明实验需重做。
附录F
（资料附录）
流感快速诊断方法
用酶免疫测定来直接查甲型和乙型流感病毒。
下列两种方法一般在15-20分钟内就可观察结果。
F1 Directigen Flu A Kit 快速诊断甲型流感病毒。
测定的第一步采集的标本用含溶解细胞的去污剂和粘液溶解剂的提取溶液处理。稀释标本使之成均质，然后，加到滤膜上。病毒抗原结合到膜上。下一步，洗掉非结合物，同时加入兔IgG来阻断膜被后来加入试剂非特异性结合。加入酶标记的抗流感病毒特异的单抗，反复洗涤后，与两种底物溶液孵育，通过测定结合酶活性来作判断。病毒抗原存在时，在膜上就可见到一个紫色三角形。病毒抗原在膜中央一个小圆区域内作为试验对照。在试剂盒中含有阳性和阴性对照材料。
F1．1 实验材料
F1．1．1 Directigen Flu A Kit
Becton Dickinson，Cat #8560-20
F1．1．2 测定标本
F1．1．3 甲型流感病毒参照抗原
F1．2 实验流程
将加样控制器嵌入检测板
分别将125ul待检样品或DMEM-S细胞培养液加入两个加液管
每个加液管内加8滴（约0.4ml）试剂A以提取抗原
于加液管上加滴头后充分混合样品
将加液管内所有的混合物逐滴加入检测板中央的检测孔
（每个加液器内的样品加一个检测板，注意避免气泡）
快速滴加试剂1， 直至加滴检测孔（冲洗）
待所以液体被吸附后去掉检测板上的加样
控制器
加4滴试剂2（封闭吸附膜以防抗体的非特异性吸附）
待所有液体被吸附后
加4滴试剂3（酶联抗体）
待所有液体被吸附后置室温2min
快速滴加试剂4， 直至加滴检测孔（冲洗）
待所有液体被吸附后
加4滴试剂5（冲洗）
待所有液体被吸附后
加4滴试剂6（底物1）
孔内出现淡黄色
加4滴试剂7（底物2）
置室温5-30 min
加4滴试剂8终止反应（柠檬酸）
F1．3 结果分析
阳性： 检测板中央可见一紫红色三角型。
阴性：检测板中央可见一紫红色圆点。
不详：检测板中央既无紫红三角型又无紫红色圆点，实验需重复。
F1．4 对照
滤器中央病毒抗原斑点作为实验对照。如果实验完毕不出现任何斑点，表明不是滤器软片就是有的试剂过期了。在试剂盒中含有阳性和阴性对照材料。病毒阳性和阴性标本可存在-20℃条件下，用做以后测定的对照。
F1．5 局限性
标本质量严重影响着测试的敏感性。当用实验室生长的病毒，其测定的水平在无细胞条件下为1000至2000蚀斑形成单位（PFU）或大约20个受感的细胞。因此，采样时必须收集足够量的上皮细胞，阴性结果不能完全排除患者得过甲型流感病毒感染的可能性。因此，阴性只可认为测不出甲型流感病毒。
如果粘液没有效溶解或从标本中去除掉，它能阻碍病毒抗原附着在膜上。这样就会造成假阴性结果。这些标本只能通过非常慢地吸附到膜来加以鉴定或把它们进一步1：4稀释后进行重测定。
在试剂盒中所含的试剂和滤器装置均有不同的有效期，用时需检查一下它们是否已过期。
F2 FLU OIA KIT 快速诊断甲、乙型流感病毒
FLU OIA 测定包含甲、乙型流感病毒NP蛋白提取和测定。这个光学免疫测定技术是通过分子薄膜光学厚度的物理改变用肉眼直接观察。这种改变是由于抗原和抗体结合到硅晶片的光学表面所造成。当提取的抗原直接放入光学表面，固定在光学表面上的特异抗体就会捕捉抗原。洗涤后，加入底物就会增加分子薄膜的厚度。这种厚度的改变就导致了反射光线方向的改变。同时肉眼所见到的为一种颜色的改变。光学厚度改变造成一种特殊的可见的颜色改变。在金黄色背景下出现紫光斑点为阳性结果。如果标本中不含有抗原，就不会被固定抗体所捕捉。因此，光学厚度维持不变，表面维持原来的金黄色，表明是阴性结果。
F2．1 实验材料
F2．1．1 FLU OIA Kit。 Biostar，Cat # FLU 30
F2．1．2 待检样品
F2．1．3 甲、乙型流感病毒参照毒株
F2．2 实验流程
从冰箱中取出试剂应置室温使之温度变至18℃-30℃。试剂盒打开后，
洗液置室温保存，如果储存冰箱，用时洗液至少置室温2h。
↓
在提取管中加入3滴标本稀释液和2滴试剂2。
↓
患者标本的拭子马上加入提取管。让拭子与溶液充分相混，
以便让液体移至纤维管的顶部。至少停留3 min但不超出5 min。
↓
当再加入一滴试剂2时，扶着拭子柄让其在提取管的倒面。
然后，用拭子让其与试剂充分相混。让拭子在管壁不断地挤压，
尽量拧干，让液体越多越好，最后拭子弃之。
↓
用干净的吸管吸一滴提取的标本直接置测试表面中心。
至少停留6 min，但不超出7 min。
↓
用洗液充分洗涤测试表面，但千万要小心，
不能将吸附在测试表面的材料都洗掉。
↓
检查并核实在测定装置盖子上的吸水纸是否是在第一部位置上。
关紧测试装置，停留10sec来去除测试表面残余的湿气。
↓
打开盖，把吸水纸置第二部位置上，在测试表面中央加入一滴底物。
至少停留6 min，但不超出7 min。
↓
10 sec，打开并检查颜色的改变。
F2．3 结果判断
F2．3．1 纯兰色/沿着中央对照点出现强的紫色反应圈为阳性结果。
F2．3．2 不出现任何反应圈，只见中央对照点者为阴性结果。
F2．3．3 如果中央对照不出现，全部实验作废，需重复测定。
F2．4 对照
每次测定必须设抗原对照，测定时在测定表面中央出现一个小兰点/紫色斑点。灭活的乙型流感病毒抗原对照用来调试试剂。无抗原对照的试验结果是不可靠的。
另外阳性和阴性对照也是必须的。阳性对照抗原为灭活的甲型流感病毒。阴性对照抗原为一种蛋白溶液。
F2．5 局限性
结果好坏取决于标本采集的质量，已灭活的病毒也可进行测定；阴性结果不能完全排除其它非流感病毒感染；阴性结果也不能完全排除患者曾得过流感感染，因此，只能解释为查不到甲型或乙型流感病毒；粪便标本不能进行测定。
F3 直接检查呼吸道脱落上皮细胞内病毒特异抗原
F3．1原理
流感病毒主要感染部位是在呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原和核酸，通过直接检查上皮细胞内病毒特异抗原或核酸即可诊断。检查方法可采用免疫荧光法查病毒抗原，一般于3-4h内即可完成，采用RT-PCR法查病毒核酸24 h内也可完成。
F3．2 标本的采集和制片
标本采集最好用负压抽取法收集呼吸道分泌物，尤其脱落的细胞。可将每标本分成两份，一份低温冻存备作病毒分离等。另一份用pH7.2的PBS将粘液吹打散，1500rpm离心15min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗1-2次，末次离心后弃上清，加入适量pH7.2 PBS使细胞垂悬，滴加于带圈的玻璃片上，室温干燥，而后冷丙酮固定10 min。
F3．3 间接免疫荧光法
F3．3．1 用10%新鲜羊或牛血清封闭标本片，置湿盒中于37℃ 30 min。
F3．3．2 分别加入适当稀释度的抗甲型和乙型流感病毒型特异的单克隆抗体，置湿盒中于37℃ 1h 。在PBS中洗两次，共10 min。
F3．3．3 加适当稀释度的兔抗鼠荧光素结合物，置37℃ 1h。在PBS中洗三次，共10 min，末次用蒸馏水洗一下。
F3．3．4 于荧光显微镜下观察结果。观察到三个以上胞浆内或胞核内荧光阳性即可判为阳性。
注：也可将采集的标本进行核酸提取，然后经RT-PCR进行扩增，能特异扩增出为阳性，不能特异扩增出为阴性。
F4 标本经敏感细胞增殖后查病毒抗原
F4．1 原理
采集标本接种敏感细胞过夜增殖后，将细胞消化分散制成抗原片，再用免疫荧光法或免疫酶染法检查细胞内病毒抗原，也可用RT-PCR对病毒核酸进行扩增和测定。
标本经敏感细胞增殖后查病毒抗原或核酸，虽需第二天方可得出实验结果，但可大大提高检测的敏感性。
F4．2 标本采集同A2。
F4．3 标本接种培养及制片。
标本接种见A5．1，置35℃过夜培育后，倒掉维持液，用消化液（1份0.25%胰酶+4份Versene）将细胞消化下来。用PBS洗一次，然后滴加于带圈的玻璃片上，室温干燥，冷丙酮固定。同法制备未经感染的正常MDCK细胞片即为正常对照细胞。
F4．4 间接免疫荧光法
见F3．3。
F4．5 间接免疫酶染法
F4．5．1加单克隆抗体同F3．3．2。
F4．6 间接免疫酶染法
F4．6．1 加单克隆抗体同F3．3．2。
F4．6．2 加适当稀释度的羊抗鼠酶标结合物，湿盒中置37℃1h，用PBS洗两次10 min。
F4．6．3加邻苯二胺底物溶液，其配制法为：4mg邻苯二胺+10ml pH5.0磷酸—柠檬酸缓冲液+15ul H2O2。
pH5.0磷酸缓冲液配制法为：先分别配制0.1mol/L柠檬酸和0.1mol/L磷酸氢二钠，然而，分别按24.3ml和25.7ml相混，再加入等容量（50ml）去离子水，混匀即为pH5.0磷酸—柠檬酸缓冲液。
加入底物液3-5min即可观察结果。
F4．6．4结果观察
于倒置显微镜下观察（观察时细胞要湿，如果细胞已干，可以加入一滴自来水）。观察到棕红色深染细胞，根据观察到此细胞多少，记录为++++，+++，++，+，±，—。以观察到一个加号以上深染细胞判为阳性；有时可观察到单个深染细胞被无色或淡红色细胞所包围，而正常细胞呈无色或淡红色，亦可判为阳性。
F5 逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）对流感诊断和流感病毒株鉴定
RT-PCR为一种很有用的技术，它能测出非常低水平的流感病毒基因组。不管病毒是活还是死的均可进行测定，因此RT-PCR技术，无论在流感诊断，还是监测和研究中均得到广泛应用。如1997年我国香港特区从患者中分离到H5N1毒株，为证实分离的可靠性就曾用该法对储存在冰箱中标本进行测定。又如近来欧美国家为进一步揭开1918年世界性流感大流行毒株之谜。将死于那次流感长期冻埋在白岭海峡的尸体挖出，取出肺，然后用RT-PCR法进行测定，取得了惊人的结果。要想使该法具有敏感性和特异性，引物序列的选择最为重要，其次要设试验对照，严防实验室交叉污染。
虽然，至今甲型流感病毒已发现的血凝素（HA）有15个亚型，神经氨酸酶（NA）有9个亚型，但许多流感病毒基因组序列已弄清。这给特异引物的设计提供了可能，同时还发现所有流感病毒各个RNA节段，其5’和3’末端均具保守性，可根据此特性来合成流感病毒的通用引物（Universal primer）。
当前在人群中同时流行的甲型流感病毒有H3N2和H1N1两亚型毒株和乙型流感病毒。1997年和1998年还发现H5N1和H9N2亚型毒株也能感染人，近来有些人推测H6亚型毒株也有可能能感染人。虽然，流感病毒在人群中能经常、连续不断地发生基因突变，有时需更换引物方可提高敏感性和特异性，但目前这已容易办到。同时流感病毒编码M和NP基因具有型特异性，而且是保守的，合成的引物可长期加以使用。
以下以鉴定H5、H6和H9亚型流感为例来加以说明。
F5．1 从病毒分离标本中提取RNA
F5．1．1 Qiagen RNAeasyTM Total RNA Isolation Kit （Catalog #74104）：
RNeasy mini spin columns （RNeasy 小旋转圆柱）
Collection tubes 1.5ml （1.5ml 收集管）
Collection tubes 2ml （2ml 收集管）
Buffer RLT （RLT缓冲液）
Buffer RW1 （RW1缓冲液）
Buffer RPE （RPE缓冲液）
RNase-free water RNA （无RNA酶水）
F5．1．2 β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇）
F5．1．3 70% ethanol （70%乙醇）
F5．1．4 Sterile 1.5ml microcentrifuge tubes （消毒过的1.5ml离心管）
F5．1．5 10、20 and 100ul adjustable pipettes and tips （10、20 和100ul可调加样器和滴头）
F5．1．6 Microcentrifuge， adjustable to 13K （可调连至13K的微型离心机）
F5．1．7 Vortex （旋转混合器）
F5．2 实验步骤
F5．2．1 把下列材料混合在一起
350ul 溶解的RLT缓冲液
3.5ul β-巯基乙醇
200ul 病毒悬液
550ul 70%乙醇
F5．2．2 用加样器将上述混合物吸入圆柱中（粉红色），10000rpm 离心15sec。
F5．2．3 取出圆柱，将收集管底部液体倒光，再将圆柱放回收集管上。
F5．2．4 向圆柱加入700ul RW1洗涤液，10000rpm离心15sec。
F5．2．5 将圆柱转至一根干净的收集管中，向圆柱加入500 ul RPE 洗涤缓冲液。
F5．2．6 10000rpm离心15sec，取出圆柱，把收集管液体倒净。
F5．2．7 向圆柱加入500 ul RPE 洗涤液，12000rpm离心2min。
F5．2．8 将圆柱转至一根消毒过干净的1.5ml 微离心管，将20 ul无RNA酶的水加到圆柱管的滤膜上，停留1min。
F5．2．9 10000rpm离心1min，收集的标本用来做cDNA 合成。也可置-20℃保存待用。
F5．3cDNA 合成
F5．3．1 材料
•; 消毒过的0.5 ml微型离心管
•;10、20 和100ul可调加样器和滴头
•; 可调至13K的微型离心机
•; 旋转混合器
•; PCR扩增仪
•; 提取的病毒RNA
•; 10mM双脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）混合物
•; 超纯水
•; 引物“Uni12” ：AGCAAAAGCAGG（1ug/ul）
•; AMV逆转录酶（25单位/ul， Life Sciences， Inc， Cat #ARB-45）
•; 5X逆转录酶缓冲液
•; RNA酶抑制剂（40单位/ul）
F5．3．2 实验步骤
F5．3．2．1 所有需要试剂均放冰上。
F5．3．2．2 标一支0.5 ml离心管放RNA。
F5．3．2．3 阴性对照管用水代替RNA。
F5．3．2．4 实验管加入4ul RNA，对照管加入4ul水，然后各加入0.5ul引物 “Uni-12”。
F5．3．2．5 置72℃ 5min。此时按以下比例制备所需的混合液：
•;1.5ul H2O
•;2.0ul 逆转录缓冲液
•;0.5ul 10mM dNTP混合物
•;0.5 ul RNA酶抑制剂（RNasin）
•;1.0ul 逆转录酶，混之
F5．3．2．6 每管加入5.5 ul 上述配好的混合液。
F5．3．2．7 将RNA ，引物和混合液相混（此时总容量应为10 ul），置42℃孵育1h。
F5．3．2．8 置95℃ 5min来停止RT（逆转录）反应。
F5．4 PCR 扩增
F5．4．1 材料
A、 用一种配对引物来扩增不同亚型毒株的RNA。
正向和反向引物各为1ug/ul。
HA-1144：GGAATGATAGATGGNTGGTAYGG
HA- 反向：ATATCGTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT
B、 用一对具有亚型特异引物来扩增不同亚型毒株的RNA。
正向和反向引物各为1ug/ul。
H5： HA-1144同上
H5-1735R（反向）：GTGTTTTTAAYTAMAATCTGTACTMA
H6：HA-1144 同上
H6-1480R：AATTCAAAGCAACCATTCCC
H9：H9-1：AGCAAAAGCAGGGGAAYWWC
H9-808R：CCATACCATGGGGCAATTAG
C、 阳性对照（可任意选择）
•;确认RT-PCR 工作，可用M基因扩增来做对照
•;所有步骤同实验组
•;正向引物：M-WSN-8：GAAGGTAGATATTGAAAGATG
•;反向引物：M-1023R：GAAACAAGGTAGTTTTTTACTC
注：W=（AT）；Y=（CT）；N=（AGTC）；M=（AC）
D、 •;消毒过的0.5 ml微型离心管
•;10、20 和100ul可调加样器和滴头
•; 可调至13K的微型离心机
•; 旋转混合器
•; PCR仪
•; TAQ DNA 多聚酶（5单位/ul，Promega Cat#M1901）
•; 10x PCR Buffer （500mM KCl，100mM Tris-HCl，1.0%Triton“三硝基甲苯”， pH9.0）
•;25mM MgCl2
•;10mM dNTP mix
•; H20
•; 消毒过的矿物油
•; 水
F5．4．2 实验步骤
F5．4．2．1 每个PCR反应只需1.5 ul合成的cDNA，把它加入到48.5 ul反应混合液中。
PCR反应混合液配制（每对引物均有空白对照）：
•;5ul PCR Buffer
•;38.65ul H20
•;1ul 10mM dNTP混合物
•;3ul 25mM MgCl2
•;0.25 ul TAQ DNA 多聚酶
•;0.3 ul正向引物（1ug/ul）
•;0.3 ul 反向引物（1ug/ul）
F5．4．2．2 简短离心，使之相混。
F5．4．2．3 管顶部加入一滴矿物油。
F5．4．2．4 把管放PCR仪上进行扩增。
•;94℃ 2min
•;94℃ 1min（解链）
•;50℃ 1min（退火）
•;72℃ 3min（延长）
•;从第二步（94℃ 1min）开始循环30周期
•;72℃ 8min
•;4℃ 保存，待用
F5．5 琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物
F5．5．1 材料
•;琼脂糖胶盘和电泳槽
•;电源和导线
•;手式紫外光线（302nm）或盒式的紫外光装置
•;照相机和胶卷
•;10ul可调加样器和滴头
•;用1X TBE 把琼脂糖配成1%
•;1X TBE Buffer
•;溴乙锭（Ethidium bromide）10ug/ul
•;加样缓冲液（GLB，30%甘油，0.25%溴酚兰和0.25%二甲苯青）
•;分子重量标准品（Low DNA Mass Ladder，Gibco，Cat#10068-013）
•;含PCR产物的微量管
F5．5．2 10X TBE Buffer 配制
•;Tris 107.8g
•;Boric acid（硼酸） 55.0g
•;EDTA （Na2） 8.2g
把上述药品用去离子水配至1000 ml，测pH值，如果pH值不是8.3±0.3，溶液需重配，不能调pH；因如果离子浓度改变会影响DNA在凝胶中移动。
10X TBE 用去离子水10倍稀释后就成为1X TBE。
F5．5．3 实验步骤
胶架上去掉封条，并把胶放入电泳槽中；倒入1X TBE，使它淹没过胶
↓
分别标记0.5 ml微离心管
↓
从每个反应管即油层下吸出4 ul PCR 产物放入相应标记的0.5 ml管中，
与3 ul胶电泳标本混合液相混
↓
在1%琼脂糖胶的第一孔放入4 ul分子量标准样品
↓
吸7ul PCR反应物，阳性和阴性对照分别加入胶中不同孔
↓
电泳槽盖上盖子，接上电源，120V电泳30-40分钟
↓
用手扶的紫外光装置来观察标准和PCR产物的光带。在302nm波长下，
结果显示清晰（254nm或366nm所得到结果不太清晰）
↓
照相来保留胶的结果
↓
PCR片段大小与分子量标准样进行比较
F5．5．4 结果解释
在实验A中，H5、H6和H9的PCR产物预计的大小均为600bp。要做亚型鉴定需将PCR进行序列测定，然后与已知的序列进行比较。
在实验B中，预计每个亚型进行了特异的扩增，如用HA-1144与H5-1735R扩增一个591 bp的片节，而与H6和H9特异引物扩增不出，可认为分离物为H5亚型流感病毒。这个结果能被PCR产物测序来加以证实。而H6基因扩增的产物为336 bp，H9基因扩增产物为808 bp。
实验C为阳性对照，M节段的PCR产物为1015 bp，阴性对照应查不出有PCR产物。 |
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发表于 2007-7-20 09:34:56