【分享】扬州大学：H5亚型禽流感病毒通过TFE3通路诱导高尔基体应激反应促进病毒复制

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论文导读

流感病毒，尤其是禽流感病毒（AIV），对人类健康和家禽产业构成了严重威胁。在病毒感染过程中，宿主细胞的内质网（ER）和高尔基体等细胞器会经历显著的应激反应。内质网应激已被广泛研究，但关于高尔基体应激（GAS）及其在 AIV 复制中的作用，目前知之甚少。高尔基体作为蛋白质修饰和运输的关键枢纽，其功能障碍可能对病毒的生命周期产生重要影响。

2024年12月09日， 扬州大学研究团队在PLOS PATHOGENS上发表题为“H5 subtype avian influenza virus induces Golgi apparatus stress response via TFE3 pathway to promote virus replication”的最新研究论文，本研究旨在探讨 AIV 感染对高尔基体的影响，以及 GAS 反应途径在病毒复制中的作用，特别是 TFE3 途径的激活及其对 AIV 复制的促进作用。

主要研究结果

1.AIV 感染在感染晚期诱导高尔基体崩溃


在这项研究中，研究人员探讨了AIV（禽流感病毒）感染对高尔基体形态的影响。结果显示，在AIV感染的晚期阶段，高尔基体出现了显著的肿胀和碎片化现象，这表明高尔基体应激反应（GAS）的存在。具体来说，研究人员使用GM130染色评估了A549细胞在感染H5亚型AIV株A/Mallard/Huadong/S/2005后的高尔基体形态变化。在感染后24小时，高尔基体开始出现碎片化，并且随着感染时间的延长和AIV剂量的增加，这种碎片化现象更加明显。值得注意的是，即使在使用4-苯基丁酸抑制ER应激的情况下，AIV感染仍导致高尔基体出现类似的碎片化，这表明GAS可能独立于ER应激发生。此外，研究人员还发现，其他亚型的流感病毒，如H1N1、H9N2和H7N9，也能在感染后36小时诱导高尔基体出现弥漫性形态，这进一步证实了流感病毒诱导GAS的普遍性。
图1. AIV感染后高尔基体的形态

2. AIV 感染主要通过 TFE3 通路激活 GAS 反应

研究发现，在AIV感染后，高尔基体内的关键蛋白修饰酶的mRNA水平显著增加，包括GALNT5、GALNT8、GALNT18、HS6ST1和B3GAT3，这表明GAS反应被激活。进一步分析GAS反应的三个主要途径：CREB3-ARF4、HSP47和TFE3，结果显示CREB3-ARF4途径在AIV感染过程中未被激活，HSP47途径在感染早期有轻微激活，但随后被抑制。而TFE3途径在AIV感染后显著激活，TFE3的mRNA水平在感染后12、24、36和48小时显著增加，且TFE3蛋白的磷酸化水平降低，核转位增加，这表明TFE3途径在AIV感染诱导的GAS反应中起着核心作用。

图2.AIV 感染后，高尔基体应激（GAS）反应通路被激活

3.TFE3 通路的激活促进 AIV 复制

在这项研究中，研究人员发现激活TFE3途径能够促进AIV（禽流感病毒）的复制。通过使用针对CREB3-ARF4、HSP47和TFE3途径的siRNA进行基因沉默实验，研究人员发现，沉默TFE3基因显著抑制了AIV的复制，表现为NP（核蛋白）表达的缺失和病毒滴度的显著下降。相反，过表达TFE3则显著增强了AIV的复制，表现为NP表达和病毒滴度的显著增加。此外，TFE3的沉默还导致AIV的HA（血凝素）和M1（基质蛋白）表达下降。这些结果表明，TFE3途径在AIV复制中起着关键的促进作用。进一步的实验还发现，TFE3途径的激活不仅影响AIV，还对其他病毒如NDV（新城疫病毒）、VSV（水疱性口炎病毒）和HSV（单纯疱疹病毒）的复制产生显著影响。

图3.高尔基体应激（GAS）反应对AIV复制的影响

4.阻断 TFE3 通路可减弱 AIV 在小鼠体内的复制和毒力

在这项研究中，研究人员探讨了阻断TFE3途径对AIV（禽流感病毒）在小鼠体内复制和毒力的影响。研究使用了TFE3基因敲除（BALB/cTFE3-/-）小鼠和对照组（BALB/cTFE3+/+）小鼠，通过鼻内感染AIV，观察小鼠的体重变化、存活率以及肺部病毒载量和炎症因子的表达。

结果显示，与对照组小鼠相比，TFE3敲除小鼠在感染后体重下降较少，且有更高比例的小鼠（五只中有三只）存活至感染后14天，表明TFE3的缺失部分挽救了小鼠免于致命的AIV感染。此外，TFE3敲除小鼠肺部的NP mRNA和HA mRNA水平显著低于对照组，这表明TFE3在AIV复制中起着关键作用。同时，TFE3敲除小鼠肺部的促炎细胞因子（包括IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8）的mRNA水平也显著低于对照组，这进一步证实了TFE3在AIV感染和炎症反应中的重要作用。

图4.小鼠TFE3敲除对AIV复制和毒力的影响

5.TFE3促进糖基化酶的表达，促进AIV复制

在这项研究中，研究人员发现TFE3能够促进糖基化酶的表达，从而促进AIV（禽流感病毒）的复制。具体来说，AIV感染显著上调了参与N-糖基化的酶的基因表达，包括ST3GAL6、MGAT2和ST3GAL1。与未感染的细胞相比，AIV感染的细胞在感染后12、24、36和48小时ST3GAL6和MGAT2基因表达显著增加，ST3GAL1基因在感染后24、36和48小时表达增加，而B4GALT1表达变化不大。

进一步的研究表明，TFE3的沉默显著降低了这些糖基化酶的mRNA水平，而TFE3的过表达则具有相反的效果。此外，过表达ST3GAL6、ST3GAL1和MGAT2可以增加AIV感染后A549细胞中NP蛋白的水平。然而，即使过表达这些糖基化酶，TFE3的沉默也会导致NP蛋白表达不可检测，这表明TFE3在AIV复制中起着关键作用。

图5.TFE3对糖基化酶表达和AIV复制的影响

6.TFE3 上调 vATPase 和 Rab7 表达，有利于内体酸化，从而促进 AIV 复制

在这项研究中，研究人员揭示了TFE3通过上调vATPase（质子泵）和Rab7的表达来促进内体酸化，从而有利于AIV（禽流感病毒）的复制。具体研究结果如下：

• 病毒RNA水平变化：TFE3的沉默导致AIV的mRNA和cRNA水平显著下降，而vRNA水平没有显著变化。这表明TFE3在病毒的转录和复制过程中起作用，但不影响病毒基因组的初始进入。
• 病毒结合与内化能力：TFE3的沉默对AIV的结合和内化能力没有显著影响。这表明TFE3的作用可能发生在病毒内化之后。
• NP蛋白核转位：在TFE3沉默的细胞中，NP蛋白在细胞核中的转位显著减少。这表明TFE3可能在病毒复制的早期阶段，特别是在vRNP（病毒核糖核蛋白复合物）核转位之前发挥作用。
• 内体酸化相关蛋白表达：TFE3的沉默导致晚期内体标记物Rab7和vATPase组分ATP6V1A的表达下降，表明内体酸化受损。相反，TFE3的过表达则增加了这些标记物的表达，表明TFE3通过促进内体酸化来增强AIV的复制。
• AIV感染对内体相关基因的影响：AIV感染显著下调了Rab5基因表达，同时在感染后24、36和48小时显著上调了ATP6V1A基因表达。此外，AIV感染在感染后12和24小时显著上调了Rab7基因表达，但在36小时后下调了Rab7基因表达。
• M1蛋白分布：在TFE3沉默的细胞中，AIV的M1蛋白在整个感染过程中保持聚集形态，表明AIV颗粒被困在内体中，无法正常释放病毒基因组进入细胞质。
  

图6.TFE3对内体酸化和AIV复制的影响

研究总结

本研究发现，H5亚型禽流感病毒（AIV）感染A549细胞后，高尔基体出现显著的肿胀和碎片化，表明AIV感染确实能够诱导高尔基体应激反应（GAS）。这一现象在感染后24小时开始出现，并随着感染剂量的增加而加剧。此外，研究还发现，AIV感染诱导的GAS主要通过TFE3通路激活，而HSP47和CREB3-ARF4通路在AIV感染过程中影响较小。TFE3的激活表现为mRNA水平的显著增加和蛋白水平的核转位，这进一步证实了TFE3通路在AIV感染中的关键作用。

AIV 感染激活的戈尔基体应激反应通路示意图

TFE3通路促进AIV复制实验结果表明，TFE3通路的激活对AIV的复制具有显著的促进作用。通过siRNA技术敲低TFE3表达，可以完全抑制AIV的复制，表现为NP蛋白表达的缺失和病毒滴度的显著下降。相反，过表达TFE3则显著增强了AIV的复制，表现为NP蛋白表达的增加和病毒滴度的显著上升。此外，TFE3的激活还促进了内体酸化和糖基化酶的转录水平上调，这些变化有助于AIV的复制。研究还发现，TFE3敲低对其他病毒（如NDV、VSV和HSV）的复制也有显著的抑制作用，表明TFE3在多种病毒复制中具有广泛的调控作用。

TFE3敲除减轻AIV在小鼠中的毒力在小鼠模型中，TFE3敲除小鼠（BALB/cTFE3-/-）比对照组小鼠（BALB/cTFE3+/+）显示出更少的体重损失，并且有部分小鼠存活至14天，表明TFE3在AIV的复制和毒力中起着关键作用。此外，TFE3敲除小鼠的肺部中病毒基因（NP mRNA和HA mRNA）水平显著低于对照组小鼠，且促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8）的mRNA水平也显著降低。这些结果进一步证实了TFE3在AIV感染中的重要性，并为开发针对TFE3的广谱抗病毒药物提供了理论依据。

源论文链接：https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012748


来源：兽医研圈 ，作者：九九