【分享】文献学习 | 中国养鸡场滑液支原体分离株流行病学调查及多位点序列分型

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大家好，今天给大家分享一篇来自华南农业大学动物科学学院张向斌教授团队在Poultry Science发表的题为“Epidemiological investigations and multilocus sequence typing of Mycoplasma synoviae isolates from chicken farms in China”的文章。了解滑液支原体的流行病学对滑液支原体的综合防控和净化至关重要。

在该研究中，作者在中国收集和分离了104株滑液支原体，采用多位点序列分型（MLST）方法将其分为8种基因型，其中ST-34所占比例最高。经BURST分析，104株分离株与56株中国分离株均归为第12群。通过邻接法构建的系统进化树显示，160株中国菌株与PubMLST数据库中的217株参考菌株分为不同的分支。该研究提示中国的滑液支原体菌株高度同源，且与国外菌株差别显著。

研究背景

滑液支原体（Mycoplasma synoviae，MS）是世界范围内重要的家禽致病菌之一。滑液支原体感染可引起急慢性呼吸道疾病、传染性滑膜炎、气囊炎和蛋壳尖端异常。滑液支原体可通过垂直和水平途径传播，并可在国际贸易中通过种蛋、雏鸡或小母鸡进行长距离传播。了解滑液支原体的流行病学和传播途径是加强滑液支原体综合防控和净化的关键。

该研究于2020年8月至2021年6月在中国8个省份收集了487份疑似样本，分离出104株滑液支原体。为了研究这些分离菌株的优势基因型，对7个管家基因进行了MLST基因型分析。本研究将有助于了解MS在中国的流行及其进化关系，为有效防治滑液支原体感染提供依据。

研究结果

从2020年8月至2021年6月，在中国的安徽、河北、山东、江苏、广东、广西、云南和贵州共采集了487份腿部样本。经qPCR检测，324份腿部样本滑液支原体感染阳性，平均阳性率为66.53%。最低检出率出现在2020年9月，54份样本中有21份阳性，阳性率为38.89%。最高检出率出现在2021年3月，57份样本的中的阳性率为94.74%（图1A）。不同区域的阳性率也不同（图1B）。其中江苏省采集样本最多，219份，阳性132份，阳性率为60.27%。贵州省17份样本检测阳性率为100%。这些结果显示滑液支原体在中国流行广泛且严重，应引起重视。324份阳性样本中分离出滑液支原体104株。


图1 2020-2021年在中国收集的样本数量。(A)在不同日期收集的样本数目。(B)从中国不同地区采集的样本数量。列中的数据是指阳性率。

将序列提交PubMLST数据库比对后，发现54株属于ST-34、ST-91和ST-93, 50株与数据库中任何ST分型不一致，说明这50株属于新的ST分型。经数据库管理员重新标注，将50株分离菌株分为ST-151、ST-152、ST-153、ST-154和ST-172。在所有基因型中，ST-34所占比例最高，为47.12%（49/104），其次是ST-153，占19.23%（20/104），其次是ST-152，占12.5%（13/104）。详细信息见表2。


表2 本研究中104株分离株的ST分型结果。

在104株分离株中，仅发现1个新的等位基因序列。经数据库管理员重新标注，JS/ZX312/2021、JS/ZX314/2021、JS/ZX361/2021、JS/ZX366/2021、JS/ZX3-1-1/2021、JS/ZX3-2-3/2021、JS/ZX3-1-3/2021、JS/ZX3-1-5/2021和JS/ZX3-6-3/2021的adk基因为adk-34。如表3所示，adk有3个等位基因，其中adk-28为优势等位基因（74/104），占71.15%。efp有2个等位基因，优势等位基因为efp-19（91/104），占87.50%。gmk有2个等位基因，优势等位基因为gmk-1（99/104），占95.19%。nagC有3个等位基因，其中nagC-10为优势等位基因（78/104），占75.00%。recA共有4个等位基因，优势等位基因recA-17（54/104）占51.92%。atpG-38和ppa-19分别是atp和ppa的唯一等位基因。


表3 7个基因的等位基因及其分布。

BURST分析用于遗传聚类分析，通过设置在4个或更多位点上与任何其他成员匹配的等位基因谱。共377个分离株，其中本研究分离株104株，国内外参考分离株273株。将属于173个STs的377株分离菌株分为16群和1个单例群（补充表3）。不同群中STs的数量差异较大。第12群最大，有160株和23个STs，占总菌株数的42.44%（160/377）。第9群为第二大群，有94株和62个STs，占总数的24.9%（94/377）。单例群有分离菌株40株，30个STs，占总分离菌株的10.61%（40/377）。

如补充表3所示，本研究的104株分离株均属于第12群。在第12群中，ST-34为中心基因型，ST-90、ST-91、ST-92、ST-93、ST-97、ST-98、ST-99、ST-100、ST-101、ST-102、ST-145和ST-153与ST-34在一个亚群（图2）。此外，ST-147和ST-172分别建立了以自己为中心的2个亚群。


图2 BURST分析组示意图。中心基因型位于中心圆圈。单位点变异（SLV）在中心轮廓周围用红色圆圈表示。双位点变异（DLV）在蓝色圆圈中显示。最远的基因型（三位点变异）用一条线连接。

此外，采用邻接法将7个管家基因的核苷酸序列连接起来，生成了377株分离株的系统发育树（图3）。作者研究的104株分离株用红色圆圈标记。在该系统发育树中，从中国分离的161株分离物中有160株聚在一起。


图3 377株滑液支原体的MLST邻接进化树。圆环（从最内层开始）包含分离物标识信息，红色圆圈表示本研究分离的菌株，不同背景颜色的分离物代表不同的群体。外三圈从内到外依次为ST型、年份、大陆。在年轮中，B 2000表示2000年以前的年份，00-08表示2001 - 2008年的年份，N表示无年份信息。在大陆圈中，A表示亚洲，AF表示非洲，E表示欧洲，N表示北美，O表示大洋洲，S表示南美洲，NC表示没有区域信息。

研究结论

本研究选取了adk、atpG、efp、gmk、nagC、ppa和recA这7个管家基因对104株菌株进行了分类。recA基因有4个等位基因，遗传变异性最高。除atpG和ppa基因外，其余基因至少有2个等位基因。在104株分离株中，仅发现1个新的等位基因序列（adk-34）。选取4个或4个以上相邻序列类型相同的管家基因进行BURST分析。377株被分为16个群和1个单例群，该研究的104株有8个STs属于第12群。此外，除山东/2019-1分离株（ST-103）外，中国分离的161株分离株中有160株被划分为第12群，说明中国分离的滑液支原体菌株高度相似，具有相同STs的菌株关系密切。山东/2019-1分离株属于第2群，中心基因型ST-44，与WVU1853T、MYCAV 365和IZSVE/3291/D13/2接近，推测山东/2019-1分离株可能是由国外传入的。

该研究利用MLST方法对2020-2021年从中国分离的104株滑液支原体进行基因分型，并与273株参考菌株进行遗传进化关系分析。这些数据进一步证明中国滑液支原体的地方性毒株是本地毒株，而不是外来毒株。对流行病学和分子流行病学数据的分析，以及对鸡传播途径、疫苗和抗生素使用的了解，将有助于对滑液支原体地方性菌株的可追溯性分析，从而有助于中国滑液支原体的综合防控和净化。

文章原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.psj.2022.102006

来源：动物支原体创新团队，作者：AnimalMycoplasma

常老师

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