【分享】在中国鸡和鹅中适应的黄病毒

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坦布苏Tembusu 样病毒是黄病毒科黄病毒属的成员，由编码三种结构蛋白（C、prM/M 和 E）和七种非结构蛋白（NS1、NS2A、 NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5）在一个开放阅读框（5）。病毒粒子包含单个拷贝的病毒 RNA，被 C 蛋白包裹，并被 180 个拷贝的 prM/M 和 E 糖蛋白包裹。在大多数黄病毒中糖基化的 E 蛋白位于病毒粒子表面，在病毒受体结合、融合和细胞进入中起重要作用。自 2010 年 4 月以来，一种与 Tembusu 样病毒密切相关的新型鸭黄病毒导致中国受感染鸭的产蛋量大幅下降。感染鸡群的死亡率为 3% 至 5%，发病率为 30% 至 100%，产蛋率下降 30% 至 60% 。当时没有其他家禽感染这种感染的报道。

自 2011 年 3 月以来，许多省份的养鸡场和养鹅场都发生了严重的落蛋病（数据未显示）。受影响的鸡和鹅的临床症状包括虚弱、厌食、体重减轻和腹泻，以及产蛋量严重下降。对产蛋量下降的鸡和鹅的尸检显示卵巢出血、卵巢炎和退化（图 1）。这种疾病对一些养鸡场和鹅场造成了毁灭性的影响，完全消除了鸡蛋的生产并造成了严重的经济损失。

图。1

图 1受感染禽类卵巢的大体损伤。显示的是卵泡出血 (A) 和卵泡退化 (B)。

产蛋量下降现象令人怀疑新型鸭 Tembusu 样病毒是导致这种疾病的原因 。然而，在感染东部马脑炎病毒 (EEEV) 的禽类和感染产蛋综合症病毒 76 (EDSV-76) 的禽类中也观察到产蛋量下降。因此，为了调查这些鸡和鹅蛋落病的原因，我们使用针对 Tembusu 样病毒的特异性引物开发了一种逆转录酶 PCR (RT-PCR)，该引物基于 Tembusu 样 NS5 基因，具有以下特性序列：NS5f，5'TTTGGTACATGTGGCTCG3'；和 NS5r，5'ACTGTTTTCCCATCACGTCC3'。EEEV 或 EDSV-76 的存在是通过使用先前描述的 PCR .收集并分析了来自 245 只鸡和 57 只患有蛋滴病的鹅的肝脏、大脑、肾脏、脾脏和卵巢样本。

NS5 特异性 RT-PCR 进行如下：简而言之，如前所述提取 RNA 。使用 5μl (5 ng) 病毒 RNA、200μM 每个引物、1× PCR 缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8.3]、75 mM KCl）、50 mM MgCl 2、0.1 mM 二硫苏糖醇设置 RT-PCR(DTT)、1 U/μl RNase 抑制剂、200 μM 脱氧核苷三磷酸 (dNTP)、1.125 U TaqDNA 聚合酶和 1 U 的 Superscript II 逆转录酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA)；加水至终体积为 50 μl。在一步反应中，RNA 样品在 42°C 下逆转录 1 小时，然后是 30 个 PCR 循环，即 94℃40 秒、55℃40 秒和 72℃ 1 分钟。通过测序确认产物的扩增；序列数据与预期的核苷酸序列完全匹配。样本中均未检测到EEEV和EDSV-76核酸序列；然而，NS5 特异性 RT-PCR 证明了 Tembusu 样病毒 RNA 的存在。

NS5 特异性 RT-PCR 的敏感性是通过测试含有鸭 Tembusu 样病毒 TA 毒株（初始滴度，7.9 × 106 PFU/ml）的尿囊液的连续稀释液和通过测试 115 个鸭子样本（来自肝脏、肾脏、脾脏、大脑和卵巢）。通过用相应临床样本的匀浆感染六个含胚卵进行病毒分离，并通过 RT-PCR 方法和如前所述的核苷酸测序证实尿囊液中存在 Tembusu 样病毒 RNA。使用这种方法，灵敏度确定为 7.9 × 10 2 PFU/ml (10 -4稀释）。NS5 特异性 RT-PCR 方法的特异性是通过检测库存病毒确定的，包括甲型禽流感病毒、新城疫病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭 1 型肝炎病毒和传染性支气管炎病毒。NS5 特异性 PCR 未检测到这些原种病毒。我们还将 NS5 特异性 RT-PCR 方法与“金标准”病毒分离方法进行了比较。通过使用 115 份鸭子样本，我们计算出 NS5 特异性 RT-PCR 方法的敏感性和特异性指标分别为 95.7% (68/71) 和 95.4% (42/44)。χ 2检验发现NS5特异性RT-PCR和病毒分离方法之间没有显着差异（P > 0.05）。

然后使用 NS5 特异性 RT-PCR 方法评估来自患病鸡和鹅的临床标本以及来自健康鸟类的标本。在测试的临床样本中，246 只鸡样本中有 138 只（56.1%）和 57 只鹅样本中有 22 只（38.6%）呈 Tembusu 样病毒阳性（表 1），而来自 25 只健康鸡和 25 只健康鹅的样本呈阳性。全部为阴性（数据未显示）。在鸡 (82%) 和鹅 (78%) 样本的卵巢中最容易检测到病毒 RNA。如前所述，将来自 Tembusu 样病毒阳性样本的 NS5 基因的 RT-PCR 扩增的 350-bp 产物克隆到 pMD18-T 载体中。使用 ABI DNA 测序仪（Applied Biosystems）对包含插入片段的克隆进行测序，并将序列提交给 GenBank。然后通过 BLAST 分析 ( www.ncbi.nlm.nih.gov )将核苷酸序列与来自 GenBank 的核苷酸序列进行比较。鸡和鹅分离株的 NS5 序列与鸭 Tembusu 样病毒 TA 株（GenBank 编号JQ289550）的 NS5 序列同源性为 99.7% 至 100%，与Tembusu 病毒 THCAr 株（GenBank 登录号AF013409）（图 2）。分离株 CK-SD-11 (GenBank no. JQ627862 ) 和 GS-PT-7 (GenBank no . JQ627864 )的完整序列分析) 显示与鸭 Tembusu 样病毒的序列具有 99.3% 至 99.6% 的同源性。

表格1

表 1使用 NS5 特异性 RT-PCR 方法在鸡和鹅临床样本中检测 Tembusu 样病毒

样品类型	阳性百分比（阳性数/总数）
鸡
卵巢	82.9 (97/117)
肝	43.5 (20/46)
肾	31.3 (10/32)
脾	23.1 (9/39)
脑	16.7 (2/12)
全部	56.1 (138/246)
鹅
卵巢	78.6 (11/14)
肝	25.0 (3/12)
肾	36.4 (4/11)
脾	20.0 (2/10)
脑	20.0 (2/10)
全部	38.6 (22/57)

图2

图 2本研究分离的病毒 NS5 基因（红色显示）与 GenBank 中其他黄病毒的系统发育关系。

为了确认落蛋病不是由另一种病毒引起的，通过感染六个胚胎鸡蛋从临床样本中分离出病毒，并收集尿囊液并检测其他病毒。血凝试验证实没有禽流感病毒和新城疫病毒；RT-PCR 方法 证实尿囊液中没有呼肠孤病毒。因此，落蛋病不是由这些病毒引起的。

通过对无特定病原体（SPF）白来亨产蛋鸡（20只/组）和本地健康白鹅（30只/组）（饲养在实验动物中心）的实验感染复制蛋滴病。本实验选用三代鸭源天布苏样病毒TA株。每只鸡皮下接种 0.5 ml 的 106 50% 鸡蛋感染剂量（EID 50/ml) 的 TA 菌株。用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 接种 20 只鸡和 20 只鹅作为阴性对照。三只随机选择的鸡在感染后第 3、5 和 7 天被处死，并使用 NS5 特异性 RT-PCR 方法测试黄病毒的存在。与对照鸡相比，感染鸡在 7 天感染期间产蛋量下降了 10% 至 45%。受感染的鸟类表现出抑郁和厌食症，但在实验期间没有鸟类死亡。阴性对照鸡没有表现出产蛋量下降或疾病的迹象。感染鸡和鹅的尸检显示感染后第 3、5 和 7 天有明显的卵巢出血。感染组中的 12 只鸡和 10 只鹅出现肝脏和肾脏肿大出血。检查的其他器官上没有肉眼可见的损伤。在感染后第 3 天和第 5 天处死的鸟类的卵巢中最容易检测到病毒 RNA（表 2 )，但在感染后第 7 天未检测到病毒 RNA。

表 2用 NS5 特异性 RT-PCR 方法在 TA 株感染的鸟类中检测病毒

感染后天数	病毒检测：
	子房	肝	肾	脑	脾
3	3/3	1/1	2/2	1/1	1/1
5	3/3	1/2	2/1	0/0	2/1
7	0/0	0/0	0/1	0/0	0/0

显示的是鸡的阳性器官数/鹅的阳性器官数，总共三个测试。

这是鸡和鹅中Tembusu样病毒感染的首次报道。对这些鸟类的分离株进行的遗传分析显示，与 2010 年鸭 Tembusu 样病毒的序列高度相似，这表明这种病毒已经适应了家禽。鉴于鸭被认为对 Tembusu 样病毒感染并不特别敏感，因此鸡和鹅中 Tembusu 样病毒的爆发是显着的，并且应考虑其可能传播给其他野生鸟类。

许多黄病毒的传播是季节性的，反映了蚊子的活动。然而，与其他黄病毒一样，在冬季分离出一些类似 Tembusu 的病毒，这可能表明蚊子不是病毒传播的唯一途径。在这项研究和早期的报告中，最容易在鸟类的卵巢中检测到病毒 RNA，这表明需要调查是否会发生经卵巢传播到卵子的情况。鸟类迁徙和受感染鸟类的运输也可能是这种病毒的传播机制，类似于其他黄病毒 。鉴于其与 Tembusu 病毒 THCAr 株的高度同源性以及早期关于在人类中存在针对 Tembusu 病毒的抗体的报道，应调查这种病毒感染人类的能力。此外，应尽快制定有效的预防和消除措施。

本报告强调了为什么需要继续监测这种病毒的扩展和传播对于估计其对亚洲禽类养殖社区的潜在影响至关重要。

来源：鸡保姆，致谢本文原作者：刘明、陈少英、陈 玉环、 刘春国、 陈世龙、 尹秀臣、 李刚、 张云，中南山编译整理

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