【分享】警惕-由蚊子引起的坦布苏病毒在中国的鸡中出现

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1. 介绍

坦布苏病毒(TMUV) 属于黄病毒科黄病毒属的 Ntaya 病毒群。第一个 TMUV菌株MM1775于1955 年从马来西亚三带喙库蚊中分离出来（Platt 等，1975），大部分 TMUV 菌株是从水禽中分离出来的。之后几年在马来西亚和泰国出现了鲎。2010年以来，鸭TMUVs（DTMUVs）主要在鸭子身上引起暴发，以产蛋鸭产蛋量严重下降、幼鸭脑炎和生长迟缓为特征，并在中国、马来西亚和泰国广泛传播。虽然有一些关于鸡、鹅、鸽子和麻雀感染 DTMUV 的报道（Yuetal., 2018)，这并没有在这些鸟类中引起流行病。黄病毒主要通过蚊子传播，然而，我们之前的研究表明，DTMUV 通过直接接触和气溶胶传播在鸭子之间有效传播, 这表明与矢量无关的传输在 DTMUV 在现场的传播中发挥了关键作用。

2021年，一种以生长迟缓、产蛋量下降为特征的传染病在中国山东和广西的鸡群中爆发。通过RT-PCR检测确定病原体为坦布苏病毒。本研究从病鸡中分离出两株坦布苏病毒 SD2021和GX2021 菌株，并进行系统发育分析。

基于 E 基因显示 TMUV SD2021 和 GX2021 与蚊子来源的 TMUV 最密切相关，这些坦布苏病毒与主要的鸭坦布苏病毒不同。鸡研究表明，TMUV SD2021在通过in或im途径接种的鸡的多个器官中感染并复制，这表明鸡TMUV已在一定程度上适应了鸡。然而，接触传播研究表明，TMUV SD2021 不会在鸡之间通过直接接触传播，这与 DTMUV 在鸭中的传播有很大不同（Yan et al., 2018）。

总体而言，这项研究表明，坦布苏病毒已经适应了鸡，并对中国的家禽业构成了威胁。

2. 材料和方法

2.1. 细胞和抗体

婴儿仓鼠叙利亚肾 (BHK-21 细胞) 获自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，并维持在添加 5%胎牛血清(FBS) (Biowest,南美洲）、100 U/ml 的青霉素和 100 μg/ml 的链霉素（Invirogen，Carlsbad，CA）在 37 °C 的 5% CO 2加湿培养箱中。鸡肝细胞癌 (LMH) 细胞系在 Dulbecco's Modified Eagle Medium: F12 (DMEM/F12) (BI, USA) 中培养，添加 10% FBS、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素，37 ℃在 5% CO 2中。我们实验室开发了针对DTMUV E蛋白的单克隆抗体（mAb）1F5（李等人，2012）。

2.2. 病毒分离

山东某肉鸡场和广西某蛋鸡场暴发的一种以鸡生长迟缓和产蛋量下降为特征的疾病。收集 36 只患病鸡（山东 5 只鸡和广西 3 只鸡）的组织样本（包括肝脏、脾脏、肺和肾脏），并在磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 中处理为 10% 匀浆，并在 12,000 下离心澄清g 4 ℃ 10 分钟。将匀浆样品通过 0.22 ?m 过滤器过滤并接种到 9 日龄无特定病原体 (SPF)鸡胚的尿囊腔中鸡蛋体积为 0.1 毫升。将接种后 2-6 天死亡的卵的胚胎汇集、均质化并离心。采用有限稀释法在SPF鸡胚蛋中纯化病毒3次。

2.3. 逆转录 PCR (RT-PCR) 和全基因组测序

使用RNAiso Plus（TAKARA Biotechnology，大连，中国）根据制造商的说明提取病毒RNA，并用作模板合成第一链cDNA。使用带有 TAP 的 5'-Full RACE Kit 和带有 PrimeScriptTM RTase 的 3'-full RACE Core Set 进行 5'-和 3'- cDNA 末端快速扩增 (RACE) 技术以扩增基因组 5' 和 3' 末端（TAKARA 生物技术，大连，中国）。对于 5'RACE，病毒 RNA 用碱性磷酸酶（小牛肠）和烟草酸性焦磷酸酶处理，然后使用 T4连接酶将去帽的 mRNA 与 5'RACE 接头连接。处理后的 RNA 用作模板，用逆转录酶合成 cDNAM-MLV（TAKARA Biotechnology，大连，中国）和随机 9mers，然后进行嵌套 PCR：外部 PCR，使用基因特异性引物 (GSP) 1 和 5' RACE 外部 R 引物；带有 GSP2 和 5' RACE 内 R 引物的内 PCR。对于 3' RACE，病毒 RNA 的 3' 末端没有 poly (A) 尾，因此使用大肠杆菌 poly (A) 聚合酶 (NEB) 将 ploy (A) 添加到 RNA 的 3' 末端. 然后使用 3' RACE Adapter 合成第一链 cDNA，然后进行嵌套 PCR：外层 PCR，使用 3' RACE 外层 F 正向引物和 GSP1 反向引物；内部 PCR，带有 3' RACE 内部 F 正向引物和 GSP2 反向引物。PCR产物被克隆和测序。

使用逆转录酶M-MLV（TAKARA Biotechnology，大连，中国）合成第一链cDNA。然后用重叠引物和Platinum Pfx DNA聚合酶（Invitrogen，Life Technologies）的九对PCR正向和反向PCR，将cDNA用于PCR扩增。将PCR产物的9个碱基纯化并克隆到pSIMPLE19载体中进行测序，并将重叠的序列合并。

2.4. 病毒滴定

为了确定病毒滴度，将组织样品称重并在 PBS 中匀浆以产生 1:1 (ml/g)的组织匀浆。通过离心澄清组织匀浆或细胞培养物，并滴定未稀释和连续稀释 10 倍的上清液对 96 孔板中 BHK-21 细胞的病毒感染性。病毒检测的下限为每 0.1 g 组织0.5 log10 TCID 50 。病毒滴度采用 Reed 和 Muench 方法计算。

2.5. LMH细胞中TMUV的生长曲线

为了测试鸡细胞中的病毒复制，在 T-25 烧瓶中生长的 LMH 细胞以 0.0001 的 MOI 感染 TMUV。将细胞与含有 2% FBS 的 DMEM/F12 在 37°C 下孵育。感染后每12小时收集上清液样品，并在BHK-21细胞上进行病毒滴定以确定病毒滴度。

2.6. 免疫荧光检测 (IFA)

LMH 细胞用 TMUV SD2021 和 GX2021 感染并通过 IFA 测试。简而言之，LMH 细胞以 0.0001 的 MOI 接种 TMUV。在 72hpi，去除细胞培养物，将感染的细胞固定并与抗 TMUV mAb 1F5 (1:200) 一起孵育 1 小时。随后将细胞用含有 0.05% Tween-20 (PBST) 的 PBS 洗涤 3 次，并与 FITC 缀合的山羊抗小鼠IgG 抗体(1:2000) (Invitrogen Carlsbab, CA, USA) 一起孵育 1 小时。洗涤五次后，使用荧光显微镜（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）检查细胞的图像。

2.7. TMUV SD2021、GX2021 和其他 TMUV 的系统发育分析

为了确定 TMUV SD2021、GX2021 和其他已报道的 TMUVs 的系统发育关系，在 MEGA 软件 v.6.0 中使用邻接 (NJ) 方法分析了 SD2021、GX2021 和其他 49 个代表性 TMUVs 的 E 基因序列的 925 bp 片段具有 1000 次自举复制。为了评估核苷酸和氨基酸的同一性，使用 MegAlign 软件 v.5.01 (DNASTAR Inc.) 比对 TMUV 的 E 基因和 E 蛋白序列。

2.8. 封闭ELISA

为了测试血清样本中的TMUV 抗体，如前所述使用封闭ELISA方法 (?Li et al., 2012）。简而言之，96 孔 ELISA 板用纯化的 TMUV 包被，并用含有 5% 脱脂牛奶的 PBS 封闭。将血清稀释 10 倍，加入孔中，将板在 37°C 下孵育 1 小时。将板用 PBST 洗涤 3 次，然后将 mAb 1F5 (1:20) 添加到孔中，并将板在 37°C 下孵育 1 小时。然后将板用 PBST 洗涤 3 次，然后加入 HRP 缀合的山羊抗小鼠 IgG (1:2000, Sigma, USA)。将板在 37°C 下孵育 1 小时，然后用 PBST 洗涤 3 次。将 3,3',5,5'-四甲基联苯胺添加到孔中，并将板在室温下孵育 10 分钟。然后通过添加0.1N硫酸终止反应。光密度(OD450nm) 测量并计算抑制百分比 (PI) 值：PI (%)  = [1 - (测试血清的 OD450 nm/阴性对照血清的 OD450 nm)] × 100%。当PI值≥18.4%时，该样本被认为是阳性。

2.9. 鸡实验

为了评估 TMUV SD2021 在鸡中的致病性、复制和传播，通过模拟呼吸道感染和蚊虫叮咬途径，对 22 只 3 周龄的 SPF 鸡组进行鼻内（in）或肌肉内（im）接种 10 SD2021 的3.5 TCID 50 ，体积分别为 0.2 ml。将 11 只幼稚鸡引入隔离器，并与每组中的接种鸡共同饲养。每天监测鸡的临床症状。在接种后 4 天和 6 天 (dpi)，三只接种鸡，以及在接触后 4 和 6 天 (dpc)，每组中的三只接触鸡用 CO 2安乐死吸入和收集脾、肺、肾、脑、卵巢、胰腺和气管的组织和血清样本进行病毒滴定。在 0、4、7 和 14 dpi 时从剩余的五只接种鸡和在 0、4、7、14、21 和 28 dpc 时从五只接触鸭中收集血清样本用于抗体检测。

我们开发了一种DTMUV FX2010-180P 减毒活疫苗（Li et al., 2014），它已在中国广泛用于预防鸭的 DTMUV 感染。为了评估获得许可的 DTMUV 疫苗 FX2010–180 P 对鸡 TMUV SD2021 的功效，用 10 4.0 TCID 50的疫苗对三只鸡进行了免疫接种。免疫后每一周检测免疫鸡的抗体效价（抑制值百分比）。接种疫苗的鸡在每周 3 周用 TMUV SD2021 攻击，攻击后 4 天对每组中的三只鸡实施安乐死。如上所述收集组织样品。

3. 结果

3.1. TMUV SD2021 和 GX2021 的隔离

一种以幼鸡生长迟缓为特征的疾病，表现出抑郁和腹泻（图1A，B），产蛋鸡产蛋量下降（图1C）在田间爆发。与健康鸡（图1E、F）相比，病鸡的脾脏明显肿胀和充血（图1D），卵巢滤泡出现出血（图1F）。从两个患病养鸡场采集的组织样本经匀浆离心，上清液进行RT-PCR和PCR检测，结果显示组织样本TMUV阳性，但常见鸡病毒阴性，包括禽流感病毒，新城疫病毒、禽腺病毒血清型4、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊病病毒 等。为分离病毒，将上清液接种到三个9日龄SPF鸡胚。所有受感染的胚胎在接种后2-6天死亡，与MOCK组相比体积更小，受感染的胚胎严重充血和出血（ 图2）A），这表明该病毒对鸡胚具有毒性。为纯化病毒，将死胚匀浆并在4 ℃下以12,000 g离心，用有限稀释法将含有病毒的上清液在SPF鸡胚蛋中纯化3次。分离出山东养鸡场6株和广西养鸡场5株，对两场11株鸡TMUV分离株中的2株进行测序验证，分别命名为坦布苏病毒 SD2021和GX2021。









图 1。临床症状和病理损害。受感染的鸡表现出（A）抑郁，（B）腹泻和（C）产蛋量下降。(D)与对照组 (E, G) 相比,脾脏表现出严重肿胀、充血和 (F)卵巢卵泡出血。

未完待续

来源：鸡保姆，致谢本文原作者：严大伟，李雪松，王占新，刘兴坡，董璇，瑞福，苏新，徐邦峰，乔阳腾，袁春秀，张志飞，刘勤芳和李泽军。中南山编译整理

张彭蒲南

期待继续分享！

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小鸡么么哒

真感觉像是生化武器。用蚊子作为载体传播

来自安卓APP客户端

hu215A01

用昆虫作载体作生物武器。日本731部队在中国患下的重罪也。

hu215A01

用昆虫作载体作生物武器。日本731部队在中国患下的重罪也。