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摘 要：
通过对2020年山东、河北、河南等16省份送检的266份家禽病料进行细菌分离鉴定、PCR检测等手段，确诊出52株鼻气管鸟杆菌，平均检出率为19.5%。对确诊病例进行流行病学分析，结果显示，该病在全国发病范围较广；一年四季均可发病，各生长阶段均可发病，且随着日龄增长鸡群发病呈增多趋势；单纯感染较少，多为两种或两种以上疾病混合感染；通过对该病流行病学分析，可为有效预防和控制该病提供参考。
鼻气管鸟杆菌病(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)是由鼻气管鸟杆菌引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，主要感染鸡和火鸡。临床表现主要是呼吸道症状、生长障碍、死亡率增加，病理变化主要是脸部肿胀、纤维素性化脓性肺炎和气囊炎。继发或合并感染比较普遍，常与禽流感病毒、大肠杆菌、传染性鼻炎、传染性喉气管炎病毒等病原混合感染，导致感染鸡群生长缓慢、死亡率增大，给养禽业造成巨大的经济损失。该病1981年由德国学者发现，1994年比利时学者才建议使用鼻气管鸟杆菌这个词语，之后在美国、德国、英国、法国、以色列、荷兰、南非等许多国家发生[1]。我国陈小玲等[2]在2000年首次分离到鼻气管鸟杆菌。泰国、伊朗、台湾等国家进行该病流行病学和血清型调查，发现ORT阳性率很高，预示该病呈蔓延趋势[3]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
来自山东、河北、河南等16省份的266份送检表现肿脸、呼吸道症状的病死鸡的病料。
1.1.2 试验动物
35日龄SPF，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。
1.1.3 试验材料
药敏片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；微量生化反应小管，购自北京陆桥技术有限公司；营养琼脂、麦康凯琼脂，TSA培养基、BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司；DL2000 DNA Marker购自上海宝生物工程有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
1.1.4 试验设备
生物安全柜，苏净安泰BSC-1600IIA2；显微镜，奥林巴斯CX-31；全自动样品快速研磨仪，上海净信科技Tiss-24；基因扩增仪，杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b)c；恒温培养箱，三洋MCO-15AC。
1.2 方法
1.2.1 临床症状与病理变化
观察记录发病鸡群临床症状及解剖病理变化，总结流行特点、临床症状及病理变化。
1.2.2 细菌分离与培养
无菌采集病料的气囊、肺脏、心血，用接种环取病料组织接种于营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板和含5%新生牛血清的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基(TSA)平板上，置37℃、含5%CO2培养箱中培养24～48 h，观察结果并对分离的细菌进行染色镜检。
1.2.3 生化试验
通过培养镜检对疑似ORT菌进行生化试验，按常规方法进行氧化酶、过氧化氢酶试验、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、尿素酶、乳糖、蔗糖、麦芽糖和果糖发酵。
1.2.4细菌PCR鉴定
取ORT菌落接种含2%新生牛血清的BHI培养基37℃温箱中培养36 h，取1 m L放入1.5 m L无菌的离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃掉上清，加入无菌水中将菌体重悬，使用振荡器震荡摇匀，沸水浴7 min，再冰浴5min,12 000 r/min离心1 min，上清液作为基因扩增的模板，-20℃保存备用。根据Gen Bank已发表的ORT 16S r RNA基因序列[4],上游引物ORT1F:5’ATAGCCCGGGGAAACTCGGATT 3’,下游引物ORT1R:5’GGCATCGTTTACTGCGTGGACT3’，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，用灭菌的双蒸水稀释为25μmol/L,-20℃保存备用，预期扩增的片段长度为500 bp。PCR反应体系为25μL:dd H2O 16.1 m L,10×PCR buffer 2.5μL,Mg2+1.0μL,d NTP 2.0μL,上下游引物0.8μL,DNA模板2.0μL,r Taq DNA polym erase0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min;94℃50 s;56℃50 s;72℃1 min,30个循环后；72℃延伸10 min。取PCR产物5μL用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 动物回归试验
将纯化后的各菌株接种于含2%新生牛血清的BHI培养基，37℃培养36 h，调整菌液浓度至109 CFU/m L，各分离菌株分别接种10只35日龄SPF鸡，每只鸡眶下窦接种0.5m L，连续观察10 d并进行解剖，记录结果。
2 结果
2.1 临床症状与病理变化
2.1.1 临床症状
发病初期只表现为轻微呼吸道症状，之后鸡群呼吸道症状越发明显。精神沉郁，眼结膜充血，伸颈呼吸，打喷嚏、甩头，流黄色粘稠鼻液，双侧鼻孔沾有污染物，单侧或双侧脸部或眶下窦肿胀。产蛋期感染还会引起产蛋下降，一般下降为5%～10%，混合感染后死亡率增加，产蛋下降幅度加大，产蛋下降高达50%。
2.1.2 病理变化
发病初期气管、支气管内有黄色粘性分泌物，胸部和腹部气囊浑浊，气囊上覆盖黄色粘性分泌物，肿胀脸颊剪开后有较多黄色干酪样物质，单侧或双侧肺脏水肿、肉样变，肺脏底部有黄色干酪物质包裹，有的形成三炎症状，包心包肝包气囊。
2.1.3 流行特点
图1是鉴定病例的省份分布。从图1可见，全国16个省份都有不同程度检出，其中ORT检出率高于或等于20%的省份有10个，分别是广西、山西、江苏、河南、山东、云南、辽宁、广东、安徽、河北，这些省份都是蛋鸡、种鸡、黄鸡养殖数量比较多、养殖比较密集区域。
图2是鉴定病例的发病月份情况。从图2可见，除9月外，其他月份均有病例发生；在3～5月份、7月份、11～12月份三个时间段高发，说明该病一年四季均可发病，温度波动较大的季节更易发生。
图3是鉴定病例的发病日龄。从图3可见，育雏期、育成期和产蛋期均有发病，产蛋期鸡群最易感染，感染比例最高，达63.5%(33/52），其次是育成期鸡群，占30.8%(16/52），育雏期鸡群发病最少（5.7%）。结果说明，鼻气管鸟杆菌病在鸡不同生长阶段均可发病，且随着鸡群日龄增长，发病呈增多趋势。
图4是鉴定病例混合感染的情况。由图4可见，在鉴定52例中，ORT单独感染为9例，占比17.3%;ORT+IC混合感染为12例，占比23.1%;ORT+E.coli混合感染为16例，占比30.8%;ORT+IC+E.coli混合感染为15例，占比28.8%。结果说明，本病单纯感染较少，两种或两种以上疾病混合感染比较多，说明在临床上鼻气管鸟杆菌混合感染普遍存在。
2.2 细菌分离与培养
经过37℃、含5%CO2培养箱中培养24～48 h,发现：在TSA培养基上形成菌落较小，呈现灰白色，不溶血，边缘光滑、半透明的露滴状菌落；在普通营养琼脂平板和麦康凯平板上不生长。染色镜检可见革兰氏阴性短杆菌，单个或短丝状，呈现多态性。
2.3 生化试验
部分分离株生化试验结果（表1）表明，氧化酶、尿素酶、乳糖和果糖均呈阳性，过氧化氢酶、鸟苷酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶均为阴性，分离菌株与参考菌株的生化试验结果相似，初步确定为ORT。
2.4 细菌PCR鉴定
分离菌株经PCR检测后，均能扩增出一条长度为500 bp条带，与阳性对照一致，阴性对照未能扩出条带。结果见图5。
注：M L2000;1、APG阳性对照；2、APG样品检测；3、APG阴性对照。
2.5 动物回归试验
动物回归试验结果显示，分离菌株均可引起SPF鸡发病，临床症状主要表现为呼吸困难、精神沉郁、咳嗽、甩头、流鼻涕，并出现单侧或双侧脸部或眶下窦轻微肿胀。病理变化主要表现为气管、肺脏出血，胸腹部气囊有纤维素渗出物。
3 讨论与小结
本实验室对2020年送检的266例病料进行实验室检测。对初步鉴定为疑似鼻气管鸟杆菌的病料进行细菌分离与培养、形态学观察、生化试验、PCR检测、动物回归试验等[5]各项实验室检测，共分离出52株鼻气管鸟杆菌，平均检出率为19.5%，与2019年检出率（14.7%）相比，检出率呈上升趋势。ORT发病率为什么在我国呈现快速上升趋势？分析原因主要有三个方面：一是ORT致病力增加；二是药物使用减少，导致细菌性疾病容易繁殖；三是应激因素增加，随着规模化、标准化养殖，风机湿帘应用不合理，鸡群容易受到冷的应激而诱发该病。
3.1
ORT是一种繁殖力比较弱的细菌，培养条件比较苛刻，生长速度比较慢，在培养时容易被其它菌掩盖，因此在培养时要格外注意，通过多部位组织培养、培养时间要超过24～48 h。PCR检测方法比较快，特异性比较强，临床上可快速诊断而被广泛应用。
3.2
对52例确诊病例进行分析，检出率较高的省份有10个，主要是蛋鸡、种鸡、黄鸡养殖数量多而密的区域；检出率较少的省份有6个，主要是家禽养殖数量较少，这说明蛋鸡、种鸡、黄鸡养殖越密集区域发病越严重，同时也说明该病流行范围比较广。
本病一年四季都可发病，气候突变导致温差较大的季节（3～5月和11～12月）和刚开始使用风机湿帘降温的季节（7月）高发。不同生长阶段的鸡群均可发病，产蛋期为疾病高发期，占比63.5%，其次是育成期，最低是育雏期。本病单纯感染较少，混合感染现象比较突出，ORT和IC、ORT和E.coli以及ORT、IC和E.coli混合感染总占比达到了82.7%，但混合感染中ORT起到的具体作用机理还需要进一步研究。建议对于该病的防控重点要做好三个方面的工作：一是加强生物安全措施，做好平时消毒工作；二是加强饲养管理，避免气候变化导致鸡舍内温差过大，风机湿帘的合理应用，避免鸡群受到冷的应激；三是做好其它疾病防控工作，尤其是鸡传染性鼻炎的防控工作，避免鼻炎发病继发该病发生。
3.3
动物回归试验中，ORT攻毒SPF鸡的临床症状不如送检发病鸡临床症状明显，可能与实际临床上见到ORT病例多为混合感染有关。攻毒后试验鸡表现轻微呼吸道症状，少数鸡流鼻涕、打喷嚏、甩鼻；肿脸数量少，肿胀程度轻；气管、肺脏和气囊上的病理变化也不如临床病例明显。预示ORT单独感染时危害不大，死亡率也不高，治疗起来比较容易，但临床上症状较轻微，容易被养殖者忽视，导致后期容易发生混合感染，病程延长，用药治疗效果差，容易复发，危害加大，尤其是产蛋期感染后抗生素禁用，无法选择药物治疗，危害更大。
目前国内对ORT重视程度不够，对ORT病原研究还不是很透彻，目前还没有相应ORT疫苗可用，只能提醒大家做好生物安全措施，减少各类应激，加强饲养管理，防止ORT发病，减少经济损失。
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