部分地区禽戊型肝炎病毒分子流行病学分析

共享精神 · 发表于 2021-3-15 09:15:10

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禽戊型肝炎病毒（avain hepatitis E virus，a HEV）属于肝炎病毒科正戊肝病毒属 B 种，是一种无囊膜的单股正链 RNA 病毒，主要流行4 个基因型：澳大利亚和韩国的基因 1 型，美国的基因 2 型，中国和欧洲的基因 3 型，匈牙利和中国台湾的基因 4 型。

该病原引起的疾病最早可追溯到 20 世纪 80 年代澳大利亚、美国、加拿大等陆续报道的鸡大肝大脾病（big liver and spleen disease，BLS）或肝炎脾大综合征（hepatitis-splenomegaly，HS），2001年确定病原并命名为禽戊型肝炎。

1994 年我国就有 BLS 抗体阳性的报告，2010 年和 2014 年分别从肉种鸡和蛋鸡群中分离到a HEV。a HEV 多感染产蛋期鸡群，病程为 1~2 个月甚至更长，临床主要表现为死淘率升高（5%~15%）。

剖检可见，肝脾肿大、出血，卵泡萎缩变形等，后期易继发细菌感染。为分析我国 a HEV 基因变异情况，对 2018 年从山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地疑似感染 a HEV鸡群中采集的肝脏、脾脏病料样品进行 a HEV RT-PCR 检测，并对 a HEV阳性产物进行 ORF1 基因序列测定与遗传进化分析。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　病料　

2018 年采集山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏 9 个省份疑似a HEV 感染的鸡肝脏、脾脏样品共计 679 份，无菌处理后，置于 -20 ℃保存备用。

1.1.2　试剂

RNAout 提取试剂盒，购自天恩泽生物公司；Hi Script?II One Step RT-PCR Kit，购自诺唯赞生物公司；DL 2 000 DNA Marker，购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2　方法

1.2.1　引物设计　参照 Gen Bank 已公布的 a HEV-ORF1 基因核苷酸序列，利用 Oligo 6.0 软件设计扩增 a HEV-ORF1 基因的特异性引物（a HEV-ORF1-F：5'-FCGTCTCGCAGATAGCAGAGTCC-3'；a HEV-

ORF1-R：5'-TATAGCCCATTCCCGCTCAATC-3'）。

引物由北京华大基因科技有限公司合成，预期扩增目的片段为750bp。

1.2.2　病毒核酸提取　组织 RNA 和 DNA 提取，按核酸提取试剂盒和核酸提取仪说明书进行操作。

1.2.3　核酸扩增　用 RT-PCR 一步法试剂盒扩增c DNA：45 ℃反转录 30 min；94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 40 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环；72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存10 min。

PCR 产物用 1.0% 琼脂糖凝胶进行电泳，置于凝胶成像系统中观察结果。

1.2.4　ORF1 基因序列分析　挑取阳性样品产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。用 Meg Align 和 Mega6.0 软件，对测定的 a HEV-ORF1 基因序列与 Gen Bank 中部分代表性毒株序列进行同源性比较和遗传进化分析。

2　结果

2.1　RT-PCR 检测

对送检的 679 份样品处理后进行 RT-PCR 检测，其中 37 份样品扩增出 750 bp 左右的目的片段（图 1），为 a HEV 阳性。将测序结果与 Gen Bank比对，结果均为 a HEV。

2.2　ORF1 基因同源性分析 从不同地区 RT-PCR 阳性样品中，随机选取15 个试验毒株 ORF1 核苷酸序列，利用 Meg Align进行同源性比较。结果（图 2）显示：试验株之间ORF1 基因同源性为90.1%~100%，而与基因 1 型的澳大利亚株和韩国株同源性为 85.5%~89.0%，与基因 2 型的美国原型株和美国无毒株同源性为85.5%~88.2%，与基因 3 型的欧洲株和中国株同源性为 86.3%~89.7%，与基因 4 型的匈牙利株和中国台湾株同源性为 86.4%~88.5%。

2.3　ORF1 基因遗传进化分析

利用 Mega6.0 对 15 株试验株的 ORF1 基因进行序列比较，绘制遗传进化树。结果（图 3）显示：15 株 a HEV 均属于戊型肝炎 B 种，形成独立的基因分支，但不属于已报道的 4 个基因型（基因 1~4 型）。

3　讨论

目前国内外都对 a HEV 进行了血清学和分子流行病学调查研究。我国南方鸡群 a HEV 血清阳性率约为 33%，广东、山东、黑龙江 3 个省份的鸡群血清阳性率约为 28.3%。这些血清学调查结果均显示，a HEV 已在我国鸡群中广泛流行。但血清学调查只能反映鸡群的抗体水平，无法检测鸡群的病原感染情况，且病毒分离难度较大；而分子生物学方法操作简单、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好，已被广泛应用于临床检测。

ORF1 基因编码 a HEV 的多聚蛋白，包含甲基转移化酶、解螺旋酶以及 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。它们是目前国内外 a HEV 的主要分型依据。

本研究通过 RT-PCR 方法，对 2018 年山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地区疑似 a HEV 感染鸡群的679 份肝脏和脾脏病料样品进行 a HEV 检测，结果检出 37 份阳性样品，阳性检出率为 5.45%，说明我国鸡群存在不同程度的a HEV感染，这应引起养鸡企业的高度重视。

通过对 15 株 a HEV 野毒株的 ORF1 基因进行测序分析，发现所检出毒株均属于 B 种，但不属于现已报道的 4 个基因型，为新亚型。通过核苷M. DL 2 000 DNA Marker ；酸同源性比对分析发现，15 株 a HEV 野毒株与基因 1~4 型的代表株同源性均低于 90%，而 15 株分离株之间的差异不大，同源性为 90.1~100%。目前关于 a HEV 新亚型的相关报道较少，本研究为我国a HEV 的分子流行病学分析提供了补充和参考。
来源：鸡保姆整理，作者：张　翔，林婷婷，刘丰波，宋姗姗，李　彬，栾栋祖，王群，刘　平，刘红祥，马　冬，任衍倍，刘　东。