浅谈|疫苗佐剂的研究进展

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佐剂（adjuvant）一词来源于希腊语“adjuvare”，其与抗原同时或预先注射，可有效增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫反应类型。免疫佐剂有诸多优点，如减少免疫针次、减少抗原用量、增强免疫反应等。

l926年，Glenny首次发现铝佐剂具有免疫增强作用[1]。20世纪30年代，Freund发明了弗氏佐剂[2]。1956年，Johnson发现来自革兰氏阴性菌的脂多糖内毒素具有佐剂活性[3]。1974年，Ellouz等人的研究表明，分枝杆菌的胞壁酰二肽也具有佐剂活性[4]。此外，免疫刺激复合物（ISCOM）、脂质体、生物可降解微球也可诱导粘膜表面产生抗体[5,6]。在20世纪初期，学者们一直致力于开发新型疫苗佐剂，但唯一获批上市的只有铝佐剂。20世纪90年代以后，几种新型佐剂陆续被批准上市（图1），改变了铝佐剂是唯一被批准用于人用疫苗佐剂的历史。

疫苗佐剂的分类

随着分子生物学的发展，不断涌现出许多新的疫苗，对疫苗佐剂的要求也越来越高，随之出现很多新型佐剂，但多数佐剂还处于临床试验阶段（表1）。疫苗佐剂种类丰富，因此分类方式也较多。按应用可分为3类：免疫调节分子、投递系统及免疫调节和投递复合系统，免疫调节分子包括Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、C-型凝集素、RIG-I样受体等天然免疫受体；投递系统包括脂质体和病毒颗粒。按类型可分为颗粒型和非颗粒型佐剂，颗粒型佐剂包括铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物（ISCOM）；非颗粒佐剂包括胞壁酰二肽及其衍生物、非离子型嵌段共聚体、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素等[7]。按作用机制可分为四类，第一类为抗原保留，如铝盐、MF59等乳剂；第二类为抗原摄取，如ISCOM、铝盐、脂质体、QS21；第三类为激活免疫反应，如CpG、MLP等；第四类为活化细胞因子，如IL-1、IL-2 、IL-18等。

疫苗佐剂的开发

目前获批上市的疫苗佐剂多数集中在微小颗粒或纳米颗粒，包括铝盐、乳剂、脂质体和病毒体。

铝盐主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾三种。目前常用的铝佐剂为氢氧化铝和磷酸铝。氢氧化铝是一种表面只有羟基基团的层状晶体（图2A），以纤维粒子形式存在，这种粒子聚集后以松散的形式存在（图2B），大小约1-10μm，只有佐剂颗粒的外层可以和抗原结合。磷酸铝佐剂是羟基磷酸铝复合物，为无定形结构（图2C），初级粒子的是直径为50nm的盘状结构，然后形成大约3μm左右的松散粒子。抗原与铝佐剂结合主要是依靠静电引力、疏水作用和配体互换三种方式[8]。铝佐剂的作用机理主要包括储存库效应、免疫刺激效应，铝佐剂还可以通过活化Nlrp3炎性小体刺激先天免疫和诱导单核细胞分泌IL-1β和IL-18[9]。此外，铝佐剂可以刺激注射部位的坏死细胞释放DNA、ATP和尿酸等损伤相关模式分子（DAMPs）[10-12]，而释放的DAMPs有助于树突状细胞（DC）和CD4+ T细胞的相互作用[13]。迄今为止，很多学者在探索铝佐剂增强免疫应答的可能机制方面进行了大量研究，但是，由于采用的试验方案存在差异，所以得出了很多不同的试验结论。因此，需要大量的工作来探索这些作用机制的相互作用和相对重要性。目前已有很多含铝佐剂疫苗获批上市（表2）。

乳剂型佐剂研发历史悠久，目前主要用于流感、利什曼病、疟疾等严重疫情的储备佐剂。1997年，含MF59的流感疫苗获批上市，迄今已应用于30多个国家。与铝佐剂的作用机制不同，MF59主要以间接方式递送抗原，它可增强抗原递呈细胞（APC）的对抗原物质的吞噬及胞饮作用，刺激单核细胞、巨噬细胞、粒细胞分泌CCL2、CXCL8、CCL3和CCL4等因子，并促进单核细胞向DC分化[15]。这些研究表明，MF59 并不是直接以DC为靶标增强抗原摄取，而是介导其上游的DC 前体细胞募集及其后续的分化来发挥佐剂作用。MF59可在注射部位募集嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，且与含铝佐剂疫苗和不含佐剂疫苗相比，含M59的疫苗可显著增加引流淋巴结中荷载抗原的APC数量[16]。另有研究表明，M59发挥其佐剂效应不需要依赖Nlrp3和caspase-1，但却与炎性小体的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和衔接分子MyD88有关[17,18]，对于这两种分子之间是否具有相同的信号通路需要进步研究。另一个乳剂型佐剂AS03已取得欧盟认证，与MF59不同，它主要在注射部位和引流淋巴结激活免疫反应[19]。目前，主要的乳剂型佐剂研发情况见表3。

脂质体主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构，可包裹多种疫苗，并有效地将抗原引入细胞内。其作用机制与铝佐剂相似，具有储存库效应，并可以增强APC对抗原的摄入。在过去的20年里，开发了大量的以脂质体为基础佐剂的疫苗，部分佐剂已进入临床研究阶段（表4）。

流感病毒体作为佐剂应用于商品化疫苗已有超过20年的时间。病毒体的佐剂效应主要是增强APC对抗原的加工和递呈作用，关于病毒体是否直接作用于DC尚存在争议。目前，已有4种以脂质体为佐剂的疫苗获批上市（表5）。

除了上述佐剂外，还有其他一些佐剂在开展研究。许多在开发的佐剂的靶标是免疫信号通路，如Toll样受体、NOD样受体、RIG-I样受体、C型血凝素受体。

对免疫佐剂作用机制研究的不断深入，可以为临床疫苗设计、合理选择疫苗佐剂提供理论依据。此外，疫苗佐剂的开发需要考虑以下几条标准：1）安全性；2）良好的耐受性；3）易于规模化生产；4）与抗原的相容性；5）有效期及生物活性；6）廉价易得。

研究表明，佐剂颗粒的大小、性状及特性影响APC对抗原的摄入[20-22]、淋巴转运[23-25]、免疫反应质量和效力[26,27]。另外，佐剂活性也受组成成分[25,28]和免疫途径的影响[29-31]。因此，设计理想的疫苗佐剂需要充分考虑一些因素的影响，具体见表6（包括但不限于表格内容）。

小结：

在过去的几十年的时间里，学者们对铝佐剂的作用机理开展了深入研究，同时也开发了大量的新型疫苗佐剂，其中有成功亦有失败。每个佐剂的作用机制都非常复杂，体外研究很难破解。佐剂的安全性至关重要[32]，迄今为止，只有5种疫苗佐剂获批上市，除SA03在部分国家出现嗜睡的不良反应外[33-35]，其余几种佐剂均安全有效。对于科学家来说，开发安全有效的新型疫苗佐剂、拓宽佐剂在疫苗中的应用范围任重而道远。

作者：岳卓

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