病毒战士：噬菌体生物学之作用机理篇（转载）

佐君畜牧

在噬菌体被发现一百年后，作为抗击细菌感染的噬菌体疗法第二次获得了人们的关注，但是它的广泛传播与使用仍然缺乏坚强有力的临床支持。

2011年7月，在与一种严重的细菌感染作斗争一个月后，一位43岁的妇女走出了位于马里兰州贝塞斯达市的国立卫生研究院临床中心。三个星期后，另外两位病人在进入该医院检查后被查出同样的细菌菌株检测阳性。在接下来的四个月中，该病的病原体，一种肺炎克雷伯杆菌的多药耐药性菌株持续地传播开来，差不多每个星期就有一位住院病人受到了感染。

医生们采取了物理和化学的方法来控制病原体。所有病人都被隔离并进行监控。在收进第四个病例后，感染的病人被安置在医院的一个隔离病区，由专业的医护小组使用专业的仪器进行护理。在病区中，不仅医护人员，而且来访者都穿戴上专用的帽子、白大褂和手套，病房地板用漂白剂进行日常清洗，重症监护病房还定时供应过氧化氢气体对病房进行净化。但是，医院里的病人还是持续地受到感染。在持续数月的疾病爆发以后，有18位病人受到了克雷伯杆菌感染，其中11人死亡。研究人员后来报道说，从这些病人体内分离出来的细菌对于大多数已知的抗生素具有耐药性，“使得一些病人没有有效的治疗选择。”

在过去十年中，抗生素耐药性已经从一种关注发展到了一种危机。除了美国国立卫生研究院发生的死亡病例外，2011年还在英国一家新生儿医院发生了12名婴儿感染上甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌（MRSA）的多药耐药性菌株。而就在2015年，碳青霉烯耐受性的肠细菌感染了7人并使加州洛杉矶市一家医院的两名感染者死亡。即使是抗生素对病情有效，它们也不总是最佳选择，因为它们在杀死病原性细菌的同时，也清除了有益细菌，有潜在的长期性健康影响。

研究人员一直在寻找更为有效的治疗方法来保护健康的微生物组。近来，他们正在更加密切地关注许多不同的病毒来攻击细菌。噬菌体可以在细菌外表面钻出孔洞来、向其中注射入它们自己的遗传物质，劫持细菌宿主的细胞机制来制造病毒拷贝，然后使用称为溶解素的蛋白质爆炸式地打开细胞，释放出数以千计的新噬菌体。这样的循环一直持续到没有细菌存活以供其杀死。（据称）噬菌体是挑剔的捕食者，只攻击特异类型的细菌，所以它们不太可能伤害正常的微生物组或任何人类细胞。而且，因为噬菌体已经与它们的细菌受害者们共同进化了数千年，不太可能出现一种导致耐药性的生存竞争。这种简单的生物学机制恢复了令人们惊奇的持久不衰的噬菌体疗法医疗实践的兴趣：用（噬菌体这种）病毒感染病人来杀死它们的细菌性敌人。

目前，大多数此类研究仍然处于临床前期，数个试验正在进行，数目日益增加的公司正向这种治疗战略进行投资。目前人们对噬菌体疗法的关注多少有些类似于抗生素发明以前的时代。那时，噬菌体疗法非常盛行，但是缺乏临床检测和监管。美国犹他大学病理学家凯瑟琳·罗克－卡瑞罗（Catherine Loc-Carrillo）说：“噬菌体疗法将重现其昔日的辉煌，抗生素出现之前，它红极一时，但是人们对其作用机理不甚了解。”

人们对噬菌体有百思不解的疑问，经常称之为“病毒暗物质”，因为人们对它的生物学非常陌生，它们在主流医学中的应用仍然面临着许多障碍。美国得州农工大学的噬菌体生物学家瑞兰德·扬（Ryland Young）认为，在没有更加稳健的研究和临床证据的情况下推进噬菌体疗法的后果可能是毁灭性的，“如果我们没有更为丰富的数据，正如20世纪20年代的情形那样，成功使用它的方法将让我们探索更长的时间。”

一个世纪的治疗方法

噬菌体疗法的起源可以回溯到100多年以前，甚至在发现噬菌体之前。1896年，英国细菌学家欧内斯特·汉金（Ernest Hankin）检测了来自两条印度河流恒河及其支流亚穆纳河的河水，当地人认为它们有治疗疾病的功效，发现了其有抗细菌活性的证据。他使用瓷制滤器滤去河水，去除细菌和较大生物体，保留下的一种混悬液可以杀死霍乱弧菌。他怀疑水中有一些未知的物质或病原体在限制当地霍乱流行病的传播中有作用。在其后的几年中，有报道说在俄罗斯和世界其他地方的天然水中发现有类似的抗细菌性能。

20年后，另一位英国细菌学家弗雷德里克·图尔特（Frederick Twort）在研究微球菌培养物时发现了一种杀菌剂，但是他还心有疑虑、不敢假定它是一种病毒。20世纪初，法裔加拿大微生物学家菲力克斯·德希瑞勒（Felix d’Herelle）对取自感染志贺菌——一种痢疾病原物的士兵的粪便滤出物进行了检测，发现了支持图尔特发现的证据。在向志贺菌培养物中加入粪便样品之后几天中，德希瑞勒观察到在培养盘上的杀灭区中有某种东西大量杀灭了病原体。德希瑞勒比图尔特更加大胆地推测和怀疑他正在观察感染细菌的病毒的工作，从希腊语“吃掉”之意引伸，他创造了术语“噬菌体（bacteriophage）”来描述这种抗菌物。德希瑞勒在1948年一篇文章中回忆说：“在一闪念之间，我明白了：导致培养皿中出现清洁斑点或区域的，事实上是一种看不见的微生物，一种可过滤的病毒，但是一种寄生在细菌内的病毒。”

德希瑞勒推测那名粪便样品杀死了培养物中细菌的士兵病人很可能会康复，其原因来自于相同的杀微生物病毒，结果他对了。四年后的1919年，德希瑞勒使用这些从已经康复的痢疾病人粪便样品中分离得到的噬菌体，成功地治愈了受到同种细菌感染的病儿。

那时候，没有人真正地看到过噬菌体。后来又过了20年，才有科学家抓拍到最早的噬菌体这种感染细菌的病毒的电子显微镜图片。但是，噬菌体疗法开始被世界各地使用，来治疗许多种感染。比利时科学家报道了注射从各种来源物中分离得到的噬菌体治愈了葡萄球菌皮肤感染；静脉内噬菌体疗法在印度被用来治疗霍乱、在法国治疗链球菌感染；在美国的研究则报道了治疗败血症和脑膜炎。

华盛顿常青州立学院的伊丽莎白·库特尔（Elizabeth Kutter）和同事合作在2011年发表了一篇关于噬菌体疗法历史的综述，评论道：这个领域的快速发展，彰显了“一个早期的、热血澎湃的时期，人们的诉求往往是过分的、经常是不现实的。但是同时，人们对噬菌体的病毒本质知之甚少，也不太注意它们的效力和局限性。”尽管事实上一些药企早在20世纪20年代就开始对这类疗法进行标准化和市场化，但是美国食品药品管理局还是不放任对它们发展的监管，因为彼时有极少的项目得到了对照临床检测，这也正是这个领域历史上的弊端所在。

1934年，《美国医学会杂志（JAMA）》发表文章分三部分首次对噬菌体疗法进行了客观的评价。作者们评估了100多篇研究论文，总结认为该治疗只对一些葡萄球菌感染是可靠的。由于缺乏双盲试验和临床研究来评价其有效性和安全性，噬菌体疗法在西方不幸失宠。人们的目光转向了抗生素，它发现于1928年，比较起来更加易于制造和标准化。但是，噬菌体疗法渗透到了世界许多角落，尤其是在东欧，在那里现代药昂贵而且经常难以找到。

这些天来，像格鲁吉亚共和国伊里亚娃噬菌体、微生物学和病毒学研究所之类的研究中心提供商业化噬菌体制备以用于特异性适应症，如大肠杆菌和志贺菌引起的甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌（MRSA）及其胃肠道感染。伊里亚娃研究所的研究人员还将噬菌体混合入按病定制的联合用药配方以治疗许多种感染。这些混合物中的噬菌体分离自与一个世纪前相同的来源：下水道、医院、河湖及其他病原体大量滋生的地方。分离自这些来源的提纯物在实验室内的细菌培养物中生长以鉴定噬菌体来靶击受研病原物。伊里亚娃研究所经过多年的研究，已经建立了仔细培育的储藏库，里面数百个药水瓶装有这样的分离物，为科学家们进行针对病人定制的组合治疗做好了准备。

研究所现任所长姆齐娅·库塔特拉兹（Mzia Kutateladze）说，她收到的治疗请求人数在不断增加，其中包括来自美国和西欧的病人。她说：“在来之前，他们就给我们寄来了临床材料，包括培养物或擦拭物。我们首先使用我们的商品化产品进行测试，如果它们没有疗效，我们就在储藏库中鉴定噬菌体，制备和检测最后的定制产品，然后才用于病人治疗。”病人们可以前来诊所就医，伊里亚娃研究所也可以寄送噬菌体给病人以供他们自己使用。

库特尔认为，伊里亚娃研究所和其他机构的成功故事将使人们更容易接受噬菌体疗法、并使之进入药典。事实上，这些小组发表的噬菌体疗法的回溯分析正在帮助研究人员们理解哪些感染会应答于这些治疗。这些数据引起了一些卓越人士的关注。2014年，美国国立过敏与传染病研究所（NIAID）报告，该研究所建立了抗菌素耐药性研究项目。世界各地的多家公司也正在积极行动，迎接噬菌体疗法的第二次到来。

噬菌体的实验室研究一般来说要有赖于认识清楚的模式系统，如大肠杆菌及其病毒；治疗人体感染的鸡尾酒疗法中使用的巨量噬菌体正在得到深入研究。噬菌体被常规认为对人体细胞无害，部分因为它们在环境和人体内是普遍存在的，对于噬菌体如何与人体细胞相互作用还知之甚少，比如它对免疫系统的影响。例如，一项近期研究报道，噬菌体可能使用组织内的粘膜表面（内含物）来改善它们的捕食活性。

瑞兰德说：“几乎所有的噬菌体生物学都聚焦于大肠杆菌内的λ噬菌体、T4噬菌体等成功的范例，大多数主要病原体的噬菌体还没有得到很好的研究。噬菌体疗法的基础科学还远远落后于医疗实践对它的要求。”

探索暗物质

自从噬菌体疗法诞生以来，治疗胃肠道感染已经成为噬菌体疗法的最成功运用之一。尽管抗生素是目前的一线用药，对于日益增加的药物耐药性及其对微生物组的破坏的关注，已经使研究人员们重新使用杀菌病毒来替代抗生素。

在实验室中评价噬菌体的杀菌活性是容易的：只要将已知数量的纯化噬菌体注入皮氏培养皿内如同草坪样滋生的微生物中，然后测量其所得的杀灭区域就可以了。但是，人体组织的某种感染看起来不像什么，只像培养皿中营养良好的细菌的单一培植作物。在疾病组织中，病原体产生大量不同的蛋白质和小分子，如同一片沼泽地，经常形成3D打印的生物膜，并且存在于复杂的微生物群落内。在这样的情形中，噬菌体如何与病原体相互作用，仍然是个谜。

对于那些有志于开发噬菌体疗法的人们来说，这种认识上的缺乏已经形成了明显的障碍。一个问题是噬菌体是否独特地适合于治疗特定的感染。例如，对于某种深度的局部病灶，噬菌体可能比抗生素的作用更好，但是很难通过血流来评估。库特尔说：“即使在细菌本来就对某种抗生素敏感的情况下，药物也经常不能达到感染部位（并形成充足的浓度）。”另一方面，一旦噬菌体到达这些部位，它们可以在病原体内部繁殖，很快上升到治疗剂量的水平。

另一个开放的问题是，治疗性病毒是如何与人体免疫系统相互作用的，它们是否有可能导致副作用。在波兰科学院卢维德克·荷兹菲尔德免疫学和实验治疗学研究所，在病人们使用其他治疗无法奏效的情况下，医生们颇富同情心地对他们进行了噬菌体疗法，研究者安德尔泽耶·哥斯基（Andrzej Górski）正在分析多年的临床数据来发现其中的奥秘。在一篇对2008至2010年间153人接受噬菌体治疗免疫应答情况的回溯分析论文中，哥斯基和他的同事们报告称，有80%的病人对噬菌体疗法反应良好。只有小量病人不得不停止治疗，因为他们出现了副反应，比如肠道治疗后出现恶心或疼痛、或者局部噬菌体应用后出现（腐蚀性）局部反应，在2015年7月马里兰州罗克维尔市由NIAID主办的首届噬菌体疗法研讨会上，哥斯基对这些情况作了报告。

哥斯基小组还评估了使用噬菌体治疗金黄色葡萄球菌骨感染的37名病人中炎症标记物如C反应蛋白和白血细胞计数，发现噬菌体疗法降低了这些标记物的水平。事实似乎是噬菌体降低了细菌引起的炎症反应，这种调整在几乎一半的病人中与阳性临床应答有关联。

通过更加仔细地观察噬菌体疗法激发的免疫应答，哥斯基和他的同事们发现，重复暴露于相同的噬菌体菌株可以激发一种适应性免疫应答，导致产生抗噬菌体抗体。在NIAID研讨会上，他报告了当使用噬菌体的鸡尾酒用药方案时，这样的抗体应答可以高于单个病毒菌株的使用。但是，这样的抗体有助于还是有碍于噬菌体疗法，仍然不清楚。在哥斯基和他的同事们的研究中，有122名病人和健康志愿者接受了噬菌体治疗，给药方式为口服或局部应用。他们发现，尽管有几位病人产生了抗噬菌体抗体，这些抗体的存在与疗法是否成功几乎没有什么相关性。哥斯基在会议上说：“当你得到了针对噬菌体的抗噬菌体血清，并不一定意味着噬菌体没有产生作用。”

噬菌体还可能引起不同的免疫应答，这种不同取决于给药方式：局部用药、口服、静脉注射或直肠给药，还取决于它们靶向的是什么组织或器官。杨瑞兰说：“为了达到疗效，噬菌体疗法往往把每种治疗混合在一起，使得人们无法认识这样的细微差别，而事实上它们彼此不同，就如同蚂蚁和大象的差别那样。”

进入主流医学

一些公司正在探索使用提纯的尾蛋白质作为抗菌物

尽管噬菌体疗法仍然面临着许多挑战，多家研究公司目前正在试图将这种治疗方法应用到主流医院。2015年9月，法国的研究人员启动了第一项多中心研究和临床试验来评估噬菌体疗法。开始于2013年的“烧伤噬菌体”项目已经进行了临床前研究，使用满足欧洲药管局（EMA）制造标准的方法来生产两种噬菌体鸡尾酒药方。目前，这两种靶向于由大肠杆菌或绿脓杆菌引起的烧伤感染的治疗方法，将对220名病人进行注射给药，其治疗结果将与那些接受目前此类感染一线药磺胺嘧啶银的病人进行比较。

与伊里亚娃研究所使用的噬菌体鸡尾酒药方一样，烧伤噬菌体疗法是一种天然产生的病毒混合物，选择标准是它们靶向特定细菌菌种的能力。绿脓杆菌鸡尾酒药方是由13种噬菌体组成的混合物，由巴黎郊外珀西军事医院的烧伤治疗中心主任、“烧伤噬菌体”项目科学家帕特里克·杰尔特（Patrick Jault）设计；大肠杆菌鸡尾酒药方则包含12种噬菌体。

数家美国公司也意在将噬菌体抽取物推进到临床试验。2009年，位于马里兰州的Intralytix公司发表了其噬菌体疗法I期临床试验结果，靶向糖尿病病人的静脉性腿部溃疡。接受噬菌体鸡尾酒药方治疗的大约40名病人中没有一人对治疗产生任何副反应，但是该公司没有对是否计划进行二期试验做出答复。同时，位于弗吉尼亚州里士满市的AmpliPhi生物科技公司于2015年11月宣布，将招募9名病人对天然噬菌体鸡尾酒药方的安全性进行检测，此药方意在治疗由金葡菌引起的慢性静脉窦感染。

不仅这些，更多的试验需要确定哪种噬菌体疗法将对哪种适应症效果最佳，以及如何扩大成功治疗药的生产规模。AmpliPhi公司CEO斯科特·萨尔卡（Scott Salka）说：“我们还无法知道这种方法将如何进入医院、什么时候可以大规模制造。”

鉴于这些思想上的障碍，由合成生物学家克雷格·文特尔创办的、位于圣地亚哥市的合成基因组学公司正在研究另外一种方法。与将天然的噬菌体混合在一起不同，该公司的研究人员正在尝试对一种合成病毒进行工程化处理，将多种噬菌体的性能组合进入单个的基因组内。合成基因组学公司的研发副总裁博林·胡碧（Bolyn Hubby）说：这样工程化的噬菌体比起将十多种噬菌体混合在一起的鸡尾酒药方来说，更易于制造，“没有非常大型的复合鸡尾酒药方使得这些产品可以与目前的良好制造工艺（GMP）标准相兼容。”

该公司目前正在应用生物信息学和病毒工程方法来认识各种噬菌体的天然宿主范围，然后插入来自其他病毒的基因，将宿主范围扩大到包括被靶向细菌的其他亚型。胡碧说：“通过反复进行这一过程，我们可以扩大噬菌体的宿主范围，同时又保持其特异性，以免共栖细菌受到影响。”最后，研究人员们计划进一步研究噬菌体的生理学机制，比如对生物膜的穿透力或者与抗生素的协同相互作用。

除了研究噬菌体鸡尾酒药方和工程化病毒这两种方法外，研究人员们还在研究噬菌体构件的工作机理。例如，位于纽约的Contrafect公司和位于荷兰的Micreos公司使用分离得到的溶解素，也就是噬菌体酶类来撕裂开细菌衣壳，病毒趁势向细菌细胞内注射入其DNA，然后病毒后代炸开细胞体。其他实验则研究噬菌体尾巴蛋白，被称为尾菌素。作为Contrafect公司的科学顾问，洛克菲勒大学的文森特·菲斯切特（Vincent Fischetti）说：此类部件缺乏在宿主内繁殖的能力，所以它们没有与携带DNA的噬菌体所固有的风险，这样的蛋白质治疗药更为易于制造和投向市场。

但是，不管一种产品是否自然衍生还是工程化得到，也不管是整个病毒还是碎片，成功的门槛都是一样的，而且很高。临床试验必须证明噬菌体疗法，不论是单独使用还是与其他药物联合使用，都优于目前的标准治疗方法。

本文发表于《世界科学》杂志2016年3期。

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