肠杆菌肽的研究现状

金益农

肠杆菌肽是由肠杆菌属的细菌产生的一类小分子量的抗菌肽，由于其抑菌能力强，引起国内外研究机构的广泛关注。我们利用蛋白质工程技术在植物乳杆菌中实现了高效生产。

　　肠杆菌肽是由21个氨基酸组成的索套肽，分子量为2.1KDa，其中N端的8个氨基酸形成一个圆形的环状结构，9-21氨基酸形成β发夹结构，贯穿圆环。通过生化和核磁共振研究发现，肠杆菌肽其中N端的8个氨基酸形成一个圆形的环状结构，9-21氨基酸形成β发夹结构。 从结构上通过非共价作用将这个尾部固定住，这个结构称为套索固定的尾部，这个结构能抵御强烈的变性条件， 故其性质非常稳定，对温度、蛋白酶、酸碱等有良好耐受性。其对大肠杆菌、沙门氏菌以及志贺氏菌具有很强的杀灭和抑制作用。研究发现，肠杆菌肽这种索套结构对于抗菌功能非常重要，用氨基酸合成的办法合成的直链多肽是没有生物活性，而结构的改变都会造成抗菌活性的下降或消失。

　　目前认为，肠杆菌肽通过两种方式抑制病原微生物：

　　1.通过抑制RNA聚合酶活性来干扰细菌mRNA以及蛋白质的合成。其依据为：（1）RNA聚合酶（RNAP）是细菌基因表达的关键酶，是一种极其复杂的分子机器。RNAP具有催化作用的核心部分由亚基α2ββ‘ω组成，分子量为400kDa。研究发现，当RNAP的β亚基发生突变后，其对肠杆菌肽产生耐受性，从而确定其靶位点为RNAP。（2）通过结构生物学发现，肠杆菌肽通过与二级通道结合发挥抑制作用，这种二级通道是由主要活性位点通道分支出来的次级通道，直径约12-15 Å，核苷酸底物通过这个通道进入到RNA聚合酶的作用位点。而肠杆菌肽与RNAP次级通道的结合会阻碍核苷酸进入酶的活性位点，从而抑制mRNA的形成和进一步蛋白质的合成。

　　2.通过改变细胞膜的通透性，从而使细菌细胞膜破碎，内容物外渗，病原细菌死亡。其试验依据如下：（1）肠杆菌肽对指数期生长的沙门氏菌和大肠杆菌的作用。加入1uM或者0.05uM的肠杆菌肽的沙门氏菌，观察到细胞生存力的下降，4小时后有活力的细胞计数下降了3个数量级别，而当沙门氏菌从培养介质中移出后，清洗然后在培养基中重悬，细胞活力没有恢复；（2）在沙门氏菌上进行的实验表明，肠杆菌肽能显著的抑制了NADH和琥珀酸脱氢酶的活性改变氧气的利用速度，而这两个酶都是协助细胞膜中穿膜的酶类；（3）因为呼吸功能依赖于完整和有功能的细胞质膜，故研究在肠杆菌肽作用下沙门氏菌膜的完整性。实验采用荧光探针DiSC3，其能研究膜电势的改变从而测定指数期生长细胞中敏感性。在对照实验中，DiSC3的荧光性随着时间有个重要的下降，显示沙门氏菌在含有葡萄糖的介质中孵育，其细胞膜会发生极化。然而，当细胞与肠杆菌肽预孵化，与对照组相比，荧光下降的更慢一点，其原因是细胞膜是不完整的，膜电势的改变敏感度下降。通过以上实验表明，肠杆菌肽是通过这两种方式来抑制和杀灭病原菌，首先通过改变膜通透性使细胞膜破损，随后进入细菌内部与RNA聚合酶结合，抑制其转录和翻译，从而使细菌破裂死亡。

　　肠杆菌肽是第一个被发现的索套结构的多肽分子。而索套肽是目前抗菌肽领域研究的一大热点，其抑菌机制与传统的抗生素有所不同，不易产生耐药性，其作为新药开发来对抗细菌感染的潜力巨大。Fabian采用体内和体外评价肠杆菌肽对沙门氏菌待抑制作用，发现肠杆菌肽体外经过24h在全血、血浆以及血清中保持完全活性，且不会出现溶血现象。与对照组比较，处理组会使全血、同源的血浆和血清中沙门氏菌的数量显著降低。使用3 mg/鼠剂量的肠杆菌进行治疗的小鼠的肝脏和脾脏中沙门氏菌活菌数显著降低了2-3个数量级，且用24小时给药和6d给药方式的小鼠结果一致。说明肠杆菌肽能在体外和体内杀灭沙门氏菌。Sophie研究发现肠杆菌肽能抑制腹泻型大肠杆菌O157，对于治疗大肠杆菌引起的腹泻具有一定的意义。

　　肠杆菌肽是一种无溶血性，抗菌活性强，不易产生耐药的抗菌肽，对于人类及动物抵抗病原菌尤其是大肠杆菌和沙门氏菌具有重要意义。