禽流感的防制——对抗禽流感的新方法——小RNA基因干涉

杜洁茹

编者按：禽流感，令人谈及色变的疾病，给养殖业带来严重的灾害众所周知，也因此每年的秋冬季节该病成为每位养殖户的重点防控对象。还记得本刊记者去参加某次会议时，一位专家谈到：要想控制你的养殖场不发病或者少发病，首先要控制好环境，提高饲养管理水平。大家常说，养重于防，防重于治。我认为应该再加上一条--引重于养。也就是“引重于养、养重于防、防重于治”，即引入健康无病畜禽；提供适宜环境、全价饲料、清洁饮水，减少应激因素；改善动物防疫条件，强化病前预防，弱化病后治疗。
　　如何才能真正有效的控制住该病的发生呢？敬请阅读本期专题。  

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对抗禽流感的新方法——小RNA基因干涉
石家庄市神九畜禽疾病防治及药物研究所
刘会芳  袁洪兴  李红园  石凤朝  刘军同

         

　　从世界范围内来看，禽流感的发生及其造成的巨大损失，与工业化性质的集约化养殖和特殊的配套系育种体系有很大关系，具有中国特色的“小规模、大群体”饲养模式下的养鸡业以及纷繁复杂的产品流通模式，更有利于禽流感病毒的发生和流行。目前广大养鸡企业和养鸡户苦于以禽流感的防控为主的鸡场生物安全问题，究其原因：一方面是因疫苗甚至新出疫苗对当下流行毒株保护率太低而遭受较大损失，而养殖主体又严重困滞于自身的诊断、分离、鉴定病毒以及自制疫苗能力的不足，从而丧失宝贵的自救机会和权力；另一方面从病原体来说，禽流感病毒本身易于变异，同时病毒在大面积疫苗抗体的压力下加速变异，使疫苗的有效周期变短，即禽流感疫苗免疫得越频繁，病毒变异越快，山东农大的试验表明，在无抗体的SPF（无特定病原体）鸡胚上，禽流感病毒传80代，其神经氨酸酶基因（N基因）特定位点也不发生变异，而在有疫苗抗体的鸡胚，病毒N基因的特定位点在病毒传到40到50代就发生稳定的有义（有害）突变。从流行病学的角度看，禽流感的变异周期约为3~4年，与养鸡业的行情周期几乎一致。
　　由于有效疫苗和治疗用的血清或卵黄抗体均依赖于及时分离的变异毒株，而且禽流感灭活苗本身不是祛除性疫苗，即使在有较高有效抗体的情况下，也只能减少而不能完全阻挡禽流感病毒对鸡体的侵入和阻止鸡体排毒，所以禽流感的有效预防和控制常处于滞后状态，而普通药物对禽流感的防控更是无能为力，所以广大从业者非常希望具有较好防控禽流感作用的药物出现，特别是能在细胞内有效抑制禽流感病毒的复制的药物。就目前的科技发展来看，相对于普通药物，小RNA基因干涉药物具有快速（24小时）、高特异性和无副作用等特点，有可能成为符合要求的防控禽流感药物。
　　1禽流感小RNA干涉
　　RNA干涉是指将外源双链RNA导入细胞后引起与其序列同源的特异基因信使RNA 降解的现象，属于转录后基因沉默 (PTGS)的一种形式。由于长链禽流感RNA片段（25个碱基以上）会受到高等动物的免疫影响，所以禽感病毒的基因干涉的研究现在已转到不受免疫影响的小RAN干涉方面，并取得了很好的效果。
　　禽流感小RNA干涉是以禽流感信息RNA上关键保守蛋白的基因为靶点，选取病毒八个基因片段上的特定基因来设计短链DNA，通过质粒来表达小发夹结构，从而在家禽细胞内破坏禽流感病毒相关关键保守蛋白的表达和合成，抑制病毒在细胞内的复制，这些蛋白主要包括：核衣壳蛋白、多聚酶复合体、基质蛋白、非结构蛋白等。小RNA干涉片段的选择都是针对禽流感病毒的不分型的保守基因，所以筛选的有效片段对各亚型的禽流感病毒都有抑制作用。
　　目前设计的禽流感小RNA基因片段在鸡成纤维细胞和犬肾细胞上抑制H9和H5亚型禽流感的效率从20%到99.2%不等，在鼠和鸡动物上的保护率从30%到100%，所以能够成为在鸡体内“扑杀”禽流感病毒（抑制破坏病毒复制）的优良手段，从而为防控禽流感的发生和流行提供新的防控方法，为减少养鸡业损失、提高鸡场生物安全度提供有效保障。
　　2表达禽流感小干涉RNA质粒的生产
　　禽流感基因干涉片段的生产有多种方法，常用的是化学合成法和基因工程菌生产法。化学合成法合成禽流感片段的直接成本大约是1克需100万元，不含营销成本和企业的合理利润，直接折算到每只鸡身上的治疗成本大约为300到500元左右，所以从经济上说几乎没有使用价值。如果将这些片段的部分基团进行修饰或改造成肽核酸，其成本会增加很多，而且片段长度会受到很大限制，更没有实用价值。
　　目前采用的是基于质粒表达的基因工程菌生产法，这种方法生产出来的质粒是长效的，质粒能够在家禽体内长效生产基因干涉片段，抑制效果可持续一个月左右。
　　这种方法的主要流程如下：一、利用信息学软件分析禽流感全基因序列，选择靶基因，设计筛选双链小RNA干涉所需的序列，化学合成其单链DNA并退火形成双链DNA片段；二、利用基因工程和分子生物学手段，将特殊载体酶切和连接退火形成的短链DNA，构建克隆质粒和表达质粒；三、将表达质粒转化进基因工程菌进行大量克隆，提取质粒并纯化；四、利用细胞培养的方法，在成纤维细胞和犬肾细胞上检测小干涉RNA对禽流感病毒的抑制作用效果，筛选有效基因干涉片段；五、利用动物试验，在小白鼠和鸡体内进行RNA干涉试验，再次筛选有效的基因干涉片段。
　　通过上述过程筛选出效果较好的表达质粒再进行大量生产，就能成百上千倍地降低成本，从而达到养鸡场能够使用的合理价格。
　　3小干涉RNA产品的升级换代
　　由于RNA病毒变异较快，病毒可能通过碱基变化逃脱小干涉RNA的攻击，所以在基因干涉产品的研发上，现在都采取多个基因干涉片段共同作用来扼制病毒的基因脱靶现象。当前科研上的更好的进展是一方面直接构建多表达禽流感RNA干涉片段，这样既能防止病毒因脱靶而逃逸，又能再次大幅降低生产成本；另一方面利用壳聚糖、聚乙二醇等材料包裹，可以将小RNA干涉质粒从冷冻储存注射使用，变成常温保存注射饮水均可，大大方便生产中的储存和使用。
　　禽流感长效基因干涉质粒，不但能对发生的疾病进行特定的快速扼制作用，还能长效清除鸡体内潜伏的禽流感病毒，这样，鸡场的生物安全系数就会大幅提高，如果在病毒污染区域内大面积应用，还能大幅降低整个区域的发病概率，这对于正处于巨变中的养鸡业中努力坚持的养殖场无疑是个很大的支持。如能加以及时更新的疫苗，则禽流感的防控就可能出现一个崭新的局面。

nitun

骗人的  不要上当

焚华血悦

非专业看不懂，或许跟干扰肽同类型，但又有多少人用？谁让假的多呢。

张彭蒲南

nitun:骗人的  不要上当  (2013-04-27 11:17) 

这种产品打着科学的旗号，骗人的手段很高明。

农夫三拳有点痛

火了，肯定能超过辉瑞，为国争光啊。

vet8qiang

其实，有疑问：
1、技术上讲，禽流感在SPF胚上，就已经在传80代后出现基因突变。在注射疫苗的情况下可能在传40代时候出现突变。突变可能出现新的流行毒株。
2、你采用的小RNA的方法最终也是造成的禽流感的基因改变。而且直接造成同一只鸡内禽流感病毒多种多样，（不能保证一次小RNA方法就根除所有禽流感病毒，环境毒也很多）所以，认为增加了禽流感基因突变的速度和可能性，实际上放大的风险。

所以不支持楼主的观点。

本人私以为，皮之不存，毛将焉附。 鸡活着，病毒就在他的体内外繁殖。 最直接的方法，就是把发病的鸡，抓出来无害化处理了。（焚烧、蒸煮）让这些病毒不存在世。另外，通过提高现有鸡群的抵抗力，降低发病的几率，不得已可以用免疫抗体防护一下。免疫是最后一道防线，一定要知道是最后一道，其他什么免疫控制，后面药物处理，都是废话。
最终药物要逐渐的少用，甚至退出，留下一些保健类的药物通过自身抵抗力。减少发病几率是前提/
免疫也会逐渐的退出，这样疫病的病原会减少，病原的变异会变慢，减少病原的含量和做好净化是前提。
最终通过饲养及配套措施，就可以发挥鸡的生产性能。

方向要明确，背道而驰，不但会影响子孙后代，甚至在当代都会让我们受到严重损失。

liu5036584

vet8qiang:其实，有疑问：
1、技术上讲，禽流感在SPF胚上，就已经在传80代后出现基因突变。在注射疫苗的情况下可能在传40代时候出现突变。突变可能出现新的流行毒株。
2、你采用的小RNA的方法最终也是造成的禽流感的基因改变。而且直接造成同一只鸡内禽流感病毒多种多样，（不能保证一次小RN .. (2013-06-05 09:55)

你说的真好，高人之外的高人，有天龙八部里少林隐居的高僧的感觉哦！