鸡传染性支气管炎实验室诊断方法研究进展

斌哥哥

摘　要：传染性支气管炎是鸡的一种重大传染病，临床上无典型的病变特征，诊断较为困难。现有的实验室检测方法有血清学、病原学和分子生物学方法，但该病病原变异复杂，血清型众多，交叉免疫性低，临床上又多采用活毒进行免疫，以至实验室无法对疫苗毒和野毒进行准确区分。为了更好地控制本病，有必要根据临床特点对目前各种检测鸡传染性支气管炎的方法及其优缺点进行分析，为临床寻找一种适合的快速准确的诊断方法、制定合理的免疫程序和发展新型的诊断方法提供参考。



传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，可造成养鸡业重大经济损失[1]。自1931年该病原发现以来，至少有29种低交叉性血清型被报道，而且新的血清型和变异株仍在不断出现[2]，因IB临床病变并非特有，寻找一种合适的诊断IB方法就显得十分的重要。

目前已建立的IB的检测方法有：①病原学方法，检测到整个IBV或其组分；②血清学方法，检测双份血清抗体或病毒特异的IgM抗体，证实血清转化现象的存在。在检测中如果能够将病原进行细致准确的区分，将使该病的防控更为科学有效[3]。鉴于此，本文对目前各种检测IBV的方法及其优缺点进行了综述。

1　病原的分离鉴定

一般认为早期分离IBV的首选部位是气管，但感染后10 d～14 d就不易分离到。SPF鸡胚、细胞培养物和鸡气管组织培养物(tracheal organ culture，TOC)均可用于病毒的分离培养。研究显示，TOC在这些生物系统中最为敏感，特别是在有野毒存在的时候。经典的病毒培养方法是将病毒通过鸡胚连续传代至鸡胚出现矮小、卷曲或死亡。若待分离的IBV已失活，或与其他病毒混合感染，随后的IBV分离都可能会失败。现一般将它与其他检测病毒抗原的方法，如免疫荧光技术(immunoflourescence assay，IFA)、聚合酶链式应(polymerase chain reaction，PCR)等结合起来，缩短了检测程序，还保持了原有的敏感性。

2　血清学诊断技术

IBV的检测均是通过IBV特异性抗体来实现的。单克隆抗体制备技术和抗原分离纯化技术的不断完善和创新，使血清学诊断技术有了很大发展，其特异性和敏感性也明显增强，因而被广泛的应用于IB的诊断中。

2.1　琼脂扩散试验

群特异性的琼脂扩散试验(agar-gel precipitation，AGP)常用来检测抗原。AGP的抗原阳性率与病毒的致病性、病毒的感染剂量、鸡的日龄及感染时抗体的存在状态有关。Witter R L证实用感染IBV 16 h～20 h的鸡胚绒毛尿囊膜制备的AGP抗原效果最佳。Gough R E、Lohr J E 的报道也先后证实，AGP具有足够的灵敏性和特异性。封文海等，王红宁等认为AGP作为IB的快速定性和定量检测，其中抗原的处理和浓度的控制是实验成功的关键。AGP试验具有操作简单、快速且便宜的特点，但也有敏感性差、时间长、结果稳定性差，不能区分疫苗株和自然感染毒株等缺点，限制了在实际中的应用。

2.2　病毒中和试验

病毒中和试验(virus neutralization test，VNT)是鉴定IBV的经典方法，也可用于检测抗体。Darbyshire J H用VNT将24株IBV分为17个血清型。该方法具有敏感高、特异强的优点。但是VNT操作复杂，费时费力，而且代价昂贵，从而限制了它的应用。中和试验可在鸡胚、鸡胚肾细胞或气管环培养物上进行，最常用的是鸡胚法，但存在个体差异问题，并且不如气管环(TOC)法经济。吴全忠等用鸡胚气管环培养物对不同IBV毒株进行了血清的交叉中和试验，证实气管环中和试验比鸡胚中和试验更准确、简单、直观[4]。但在实际应用中，TOC实验存在操作严格、费时费力、代价昂贵的难题。

2.3　免疫荧光技术

免疫荧光技术(IFA)可用于IBV和抗体检测及抗原组织定位的研究。Braunehe Gentry最早将IFA应用于检测病鸡气管涂片中的IBV。Johnson R B证实感染IBV的鸡气管冷冻切片作为抗原的效果比肾细胞效果好。1995年Wit应用IFA鉴定IBV型特异性和群特异性抗原，准确率达70%。Wang C等[5]进行了免疫荧光和分子生物学技术在IBV鉴定和分型上的应用比较，结果IFA的敏感性相对较低，尤其是2种或更多毒株同时感染时IFA的检出率较低。封文海等认为IFA具有足够的的敏感性；朱建国等还在IFA中引入了单抗提高其特异性；刘兴友等证实胰酶分散法与冰冻切片制备抗原建立的IFA效果一致。现在一般认为IFA是实验室检测IBV的一种快速、灵敏、成本低的方法，但操作上较复杂，不宜做临床快速诊断。

2.4　血凝和血凝抑制试验

IBV本身没有血凝性，但经一定处理后会产生血凝(haemaglutination，HA)性。Bingham R W首次发现IBV经过磷脂酶C处理后能凝集鸡红细胞，而且这种凝集作用可被特异性的抗血清所抑制。在此基础上，Alexander D J等建立了肾型IB的血凝抑制(haemaglutination inhibition，HI)试验方法，并将其标准化，从而为IB的诊断提供了一种简单、快速、特异性强的血清学方法。康佐文等[6]用系统交叉血凝抑制试验将4株IBV地方分离株分为了2个血清型；吴延功等证实IBV用兔A型产气荚膜梭菌培养液处理后同样能凝集鸡的红细胞，并且血凝性还受Na＋和Mg2＋离子浓度、IBV毒株类型、凝集细胞类型等影响，这可能会给HA方法的标准化带来不利因素。

2.5　酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)可以检测抗体，也可以检测抗原。自20世纪80年代以来，ELISA被广泛应用于大批量鸡群IBV的近期感染、持续感染状况的检测，比其他方法灵敏、简便、快捷。近年来单克隆抗体的引入大大增强了ELISA检测技术的特异性，可以用于IBV的分型研究。

2.5.1　间接ELISA　主要用于抗体的检测，较一般的血清学试验敏感，适用于大规模血清学调查。李锋采用超速离心加蔗糖密度梯度离心方法纯化了IB的病毒粒子作为包被抗原建立了检测IBV抗体的间接ELISA ，结果表明此ELISA方法的灵敏度可达到血清中和试验的2.3倍，AGP的188倍，达到了国际上和国内学者建立的同类方法的灵敏度水平。许兰菊等用同种方法建立的ELISA检测54群发病鸡，其抗体阳性率为100%。王君玮等[7]应用此ELISA建立了检测IBV抗体IgG和IgM的间接ELISA。Ndifun A等[8]，Wang X等[9]分别利用大肠埃希菌中表达的重组的IBV N蛋白和部分S蛋白作为包被抗原建立了ELISA。以单个抗原重组蛋白为基础建立的ELISA，没有活病毒粒子的存在，提高了检测的特异性和安全性，显示了很好的应用前景，但用表达蛋白作为诊断抗原尚处于探索阶段，缺乏临床应用证明，要应用于生产还需要进一步完善。

2.5.2　Dot-ELISA　用于检测抗体或抗原，以硝酸纤维素膜(NC)等固相化基质膜为载体的ELISA，该方法与间接ELISA方法相比只是包被的固相载体不同，具有简便、经济、结果判定直观等优点，但也存在结果判断主观性强的不足，适合IBV抗体的定性检测。另外，还有人将生物素、亲和素系统与Dot-ELISA相结合，建立了ABC-Dot-ELISA用来检测IBV。

2.5.3　抗体捕获ELISA　用于抗体的检测，J J De Wit 建立了抗体捕获ELISA方法检测IBV特异性抗体IgM。试验结果表明，特异性达到99%，敏感性达到93.5%。IgM的产生早，且持续时间短，因此可作为IBV早期感染的判断依据之一。但检测前要先分离纯化IgM，不适于检测大批量的样品[10]。

2.5.4　单抗夹心ELISA　主要用于检测IBV抗原，该法用一株单抗包被ELISA板，另一株单抗与酶结合制成酶联试剂。与血清试验相比，该法有很高的特异性，但检出率不高，对个体鸡的IBV检测须结合鸡胚传代进行，才能得到较准确的结果。

2.5.5　双抗体夹心ELISA　武志强采用多抗作为第一抗体包被ELISA板，单抗作第二抗体，中间夹被检材料，用标记的抗鼠IgG为指示系统，建立ELISA法检测IBV。该法较适于检测病料和感染鸡胚尿囊液中的IBV，但要求病料中病毒含量达到TOC半数感染量为10－5时方能检出，而此时已到了IB急性发病中期(通常感染后4 d～7 d)，尤其不适于海关检疫。

2.6　免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(Immune Colloidal gold technique，ICGT)产生于20世纪60年代，最先用作电镜的示踪标记物，自20世纪80年代以来，Zavala M E建立了银加强免疫金银染色(silver-enhanced colloidal gold assay，SECGA)，才大大提高了该方法的灵敏度。其原理是以微孔滤膜为载体，以红色胶体金作为标记物，通过渗滤而逐步反应，整个过程3 min～5 min内即可完成，该法被认为是微生物诊断技术标准化最有前途的新技术之一，在禽病诊断上发展很快。卢伟东等将SECGA应用于IBV抗原的研究，以金标金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为探针，对纯化IBV的最低检出量可达为0.431 ng/点。陈红英用该法检测自然病例样品中IBV的检出率可达80%，高于鸡胚培养法3代～5代后出现侏儒胚的阳性率；对鸡胚尿囊液DIGFA法检出率为100%。王泽霖等[11-12]将群特异性单抗应用于SECGA，使最低检测达到了10－2～10－9半数感染量，检出时间提前到SPF鸡感染后的第3天，但存在操作繁琐、银染耗时太长的问题。

3　分子生物学检测技术

在IBV早期诊断中，分子生物学检测技术在特异性、敏感性、快速、安全性等方面具有普通的血清学诊断技术所不具有的很多优势，现已成为实验室检测中一个重要的方面。

3.1　反转录-聚合酶链反应

反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase PCR，RT-PCR)方法具有敏感、特异、快速等特点，既可利用通用引物检测不同来源、不同血清型的IBV，对于某些差异较大的毒株也可通过设计型特异性引物进行区分。Jackwood W M用此法与生物素标记的探针进行斑点杂交结合，结果待检8株病毒均被检出。Keeler J通过设计S1基因通用性引物和6个型特异性引物，成功扩增了来自于北美、欧洲及澳大利亚的共31个分离株的S1基因并进行了区分。王林川等率先在我国采用RT-PCR技术检测广东分离的IBV。随后赵建梅等[13]建立了同时检测IBV多种病原的一步多重RT-PCR方法，极大的提高了此方法的检测范围。祝玉卿等[14]将免疫荧光和RT-PCR结合，在24 h便从人工感染IBV-M41的SPF鸡气管中检到IBV的存在，大大提高了检测的灵敏性，但操作需要具有一定的分子生物学背景，存在实验室污染的假阳性情况，因此一般不作实际临床推广应用。

3.2　 RT-PCR结合探针技术

应用标记技术制备放射性标记或生物素标记的核酸探针结合聚合酶链反应(PCR)用于IBV的检测，具有敏感、特异、快速等优点。Kwon H M应用PCR和生物素标记的DNA探针检测了接种IBV的SPF鸡气管中的IBV基因组，证实此法比电镜观察病毒法要灵敏，但从病料的处理及检测的过程来看，该方法比较费时。Falcone E D、刘滨东、刘思国先后建立了用于检测IBV 保守的N基因的PCR结合探针技术，整个过程一般不超过12 h，可用于气管、肺脏、盲肠扁桃体及肾脏等组织中检测病原，并且在肾脏和盲肠扁桃体中可持续到第21天，具有灵敏、快速特异的优点。王泽霖等[15]用地高辛标记IBV标准强毒株M41和T株的S1基因探针与IBV病毒RNA进行斑点杂交，结果显示具有很高的敏感性。地高辛标记探针避免了放射性物质的辐射危害，是一种安全、简便，抗内源物质干扰的标记方法。

3.3　RT-PCR和限制性片段长度多态性分析法

由于IBV基因组的点或部分基因突变、缺失、插入和不同毒株之间的同源重组等所造成的高度变异，致使对IBV的准确诊断和分型比较困难，因此，目前广泛应用于IBV诊断及分型的是RT-PCR及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析技术。它的原理是通过RT-PCR方法扩增到DNA片段后用限制酶消化，根据酶切图谱对IBV进行分型鉴定。Kwon H M用RT-PCR扩增IBV S1基因，利用一级分类酶HaeⅢ、二级酶XcmⅠ、三级酶BstYⅠ酶消化PCR产物后电泳，对25株IBV进行了分类，结果与中和试验基本一致。Lin Z应用此法对IBV的S2基因分型方法与IBV的VN方法比较，两方法很相符。步志高等应用RT-PCR /RFLP结合VNT对分离自国内不同地区的8个分离株进行了分析，将国内分离的8个毒株划分为3个基因型，其基因分型结果与VNT结果相符。磨美兰等[16]用两种引物结合的方法，对8个IBV分离株进行扩增，并进行RFLP分析，结果可以将其细分为7个基因型，更好地区分了不同的IB毒株。这表明PCR-RFLP分型方法不仅适用于IBV的快速检测，而且可以用于IBV的血清分型。但该法也存在许多不足的地方，如同一血清型的分离物酶切基因选择不同，图谱与血清型的相似层度就不同；有的毒株用多种内切酶也难以区别，如JMK、Gray株；难以区分多个血清型的混合型；新的血清型或亚型需要新的特异性引物扩增等，所以此方法还需血清学中和试验进一步辅助完善。

3.4　RNA T1酶指纹图谱技术

利用RNA T1酶消化病毒RNA，进行耐受片段的放射性标记，电泳之后自显影得到RNA T1酶指纹图谱，不同毒株间的差异可准确的反应在图谱的产物位置上。这种诊断方法需要大量高度纯化的病毒粒子供提取病毒RNA，具有高度的特异性和敏感性，并可用于新出现变异株的检测以及IBV血清型的鉴定。

3.5　PCR-ELISA

此法是PCR技术与ELISA技术结合所产生的一种检测方法。主要应用其检测IBV样品中的特定基因，如S1基因。在基因扩增后，引入ELISA技术替代电泳检测，方便进行大量样品处理，且其灵敏度较溴化乙锭印染琼脂糖凝胶高100倍[17]。

3.6　实时荧光定量PCR

将PCR技术与荧光探针技术相结合，根据探针荧光随着时间的变化而做扩增曲线来判定是否有相关病原存在，具有极高的特异性和灵敏性，几乎可达到鸡胚试验，并且耗时仅需3 h～4 h，具有极大的发展前途。Jackwood W M等[18]根据应用实时荧光PCR中的FRET技术设计多种特异性探针，根据各种探针的裂解曲线不同而进行待检病原的区分，建立了同时检测9种IBV毒株的实时荧光PCR方法，结果发现标准毒株均能被很好的区分，但在临床上因判定的范围太小，无法进行众多变异株的分类检测，仅能作为实验室疫苗毒株的区分鉴定。

3.7　基因芯片技术

基因芯片是生物芯片中的一种类型，工作原理与经典的核酸分子杂交方法一致，主要是在玻片或硅片等支持物上有序而高密度固定排列了成千上万的寡核苷酸探针，然后对荧光标记样本进行杂交，获取样品序列信息，从而实现准确、快速、高通量的检测，具有高度平行性、多样性、微型化和自动化的特点[19-20]。曹三杰[21]选择氨基化的基片，成功制备了 NDV-IBV、AIV-IBDV诊断基因芯片，与 RT-PCR相比，NDV、IBV单个检出率分别低3%、3%，NDV、IBV或NDV、IBDV同时分别低3%和0，基本一致。陈凤梅[22]研究表明该法的敏感性比PCR凝胶电泳高1万倍，重复性可达90%～100%，但该检测方法要求非常严格，易出现假阳性和假阴性结果。吴时友等[23]尝试了在硝酸纤维素膜上制备检测鸡新城疫等14种病毒病的基因芯片，效果良好。至今还未见该方法用于IBV病原分类检测的报道，但此方法优点众多，在未来的快速检测中一定会有极大的潜力。

4　结语

在规模化养殖中，一种诊断技术的应用往往受到多种的因素影响，如品种、个体大小、免疫程序、饲养的方法和环境、以往病史、混合感染的存在、样品采集的时间方法以及免疫抑制等。因而在现有的情况下，IB的诊断应先根据临床特征进行初步估计，再利用已有的条件，选择合适的血清学或病原学检测方法，快速确定病原，制定合适的免疫程序，才能更科学合理的实现规模化养殖的整体防疫，达到最大化的降低成本。