鸡毒支原体和大肠杆菌混合感染的诊治
惠中公司技术部：王勇摘 要: 2009年4月12日在河南某肉鸡养殖小区发生了以流鼻液、打喷嚏、咳嗽、气管啰音、有吞咽动作、频频甩头、采食量减少等临床症状的疾病，并很快出现死亡，经微生物学、血清学、动物试验等方法对该病例进行诊断，最后确诊为大肠杆菌与支原体的混合感染。通过药敏试验选择了赛福康、妙富、感康等敏感药物，联合使用饮水、拌料，再加上及时采取隔离、消毒、加强管理等综合应急措施，有效的控制了疫情的发展和传播，使损失降到了最低。上述结果表明，不同地区致病性的大肠杆菌、支原体的血清型不同，对药物的敏感程度也不一样，要想对该地区的这类疾病有一全面综合把握，必须借助实验手段。
关键词: 支原体大肠杆菌 混合感染微生物学诊断血清学诊断平板凝集试验药敏试验动物试验
禽支原体病是由支原体引起禽感染发病的一类疾病的总称。禽源性支原体有鸡支原体、滑液支原体、鸡支原体、雏鸡支原体等25种，其中鸡毒支原体对家禽业影响最大。其特征性症状为呼吸道啰音、咳嗽、气管炎、气囊炎、流眼泪、甩头等。而禽大肠杆菌病是由某些致病性大肠埃希氏菌引起的肠道非传染性疾病的总称，主要有败血型、肠道型、神经型、关节型、内脏型、脑型等，其中败血型、内脏型、脑型有不同程度的呼吸系统症状。两者混合感染是肉鸡养殖中最常见、危害最严重的疾病之一。导致鸡群生长缓慢、患鸡死亡率升高、治疗困难、患鸡治愈后饲料报酬下降、酮体加工过程废弃增多，加之兽药、疫苗、人工费等支出给养殖户带来严重的经济负担。该病主要是以病鸡群最初流鼻液、打喷嚏、其后出现咳嗽、气管啰音、有吞咽动作、频频甩头、采食量减少及生长发育受阻，排灰白色或黄绿色粪便。发病后期，鸡冠呈暗红或紫色，鼻腔和眶下窦中蓄积分泌物，致使眼睑封闭、突出，同时积有脓液、失明，单侧性较多，病鸡多数以3～4d后开始死亡，死亡率逐渐上升等为临床症状。因此，要避免该病的发生，降低养殖风险，保证养殖业健康快速发展，应根据其具体发病特点采取综合的预防、治疗措施。
在2009年4月河南某养殖小区病例，经临床诊断、实验诊断，确诊为鸡毒支原体和大肠杆菌的混合感染，现将该病的诊治情况总结如下：
1材料与方法
1.1 病例介绍
该养殖小区于2009年4月12日进20000只AA肉雏鸡，在2日龄有60多只雏鸡死亡，剖检多为腹水、黑脐，部分雏鸡内脏有尿酸盐沉积。该小区用的是以庆大霉素为主要成分的开口药（按标准量饮水），用药四天后，鸡群状况良好，死亡率下降。但在10日龄ND-IB二联苗点眼免疫后的第二天鸡群开始出现呼噜、甩鼻、咳嗽、精神沉郁、采食量下降、拉稀便等临床症状。三天后开始出现死亡增加，且鸡群状况越来越差。
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精神沉郁、呆立不动
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病鸡流眼泪、流鼻液
1.2 剖检变化
早期死亡病例，剖检可见内脏实质器官充血、瘀血；肝肿大，暗紫色；心包腔及腹腔内有淡黄色渗出液。死亡高峰病例，剖检可见气管内有黏液性渗出物，气管C形环有轻度出血鼻窦肿胀充血；心包膜增厚、灰白色与心肌发生粘连；肝脏肿大，易碎，其上有一层灰白色纤维素膜包裹；胸部和腹部气囊膜增厚，混浊，其上附有纤维素性或黄白色干酪样渗出物；肺脏瘀血，充血；肠内充满气体；十二指肠出血，小肠黏膜充血、出血；盲肠扁桃体肿胀，出血，坏死。
1.3 实验室诊断
1.3.1 病料的采集及抹片镜检 无菌采取典型症状的病、死鸡气管或气囊渗出物、鼻甲骨、鼻窦的渗出物或肺组织、心脏及肝脏等作为病料，进行涂片，经化学固定后用革兰氏染液、姬姆萨染色液进行染色、镜检。
1.3.2 病原体的分离鉴定及纯培养 取典型症状的鸡只心血及肝脏作为病料，利用无菌操作的方法接种于普通琼脂培养基、肉汤培养基、麦康凯培养基、SS培养基、伊红美蓝琼脂培养基上，然后将其倒叩在37℃恒温箱内培养24h。再无菌采取病、死鸡气管、气囊或肺组织等病料，直接接种于PPLO肉汤培养基和琼脂培养基上，用解剖显微镜观察，后期减少观察次数。若发现没有菌落生长弃去。
从上述培养基上挑取有特征性的疑似菌落进行革兰氏染色、姬姆萨染色和镜检。如果染色后的细菌形态特征与怀疑的致病菌相似，将其对应的剩余菌落接种到鉴别培养基和肉汤培养基、PPLO琼脂培养基上，进行纯培养。
1.3.3 生化试验 从纯培养基上钓取特征性单个可疑菌落接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、靛基质、MR、VP、硫化氢、 枸橼酸盐、明胶、硝酸盐、尿素酶等生化培养基上。37℃培养48h。
1.3.4 致病性试验（动物试验） 将15只3周龄健康肉仔鸡，随机分成两组。试验组12只。分别肌肉注射细菌肉汤培养液0.1 ml、0.5 ml和1 ml，腹腔注射0.2 ml，各3只，对照组3只不注射菌液。
1.3.5 血清学诊断（平板凝集试验） ① 抗原：系用MG S6株的牛心汤培养基物经浓缩、染色制成的蓝色菌体悬浮液。② 操作：用前 10分钟自冰箱取出抗原，使抗原温度达到室温（15～25℃），并充分振荡均匀，吸取抗原液 2 滴加在玻璃板上，自被检鸡翼静脉采血 1 滴，放在抗原中混合均匀后摆动平板，同时用抗原 1 滴加阳性血清 1 滴作为对照。2min判定结果。
1.4 药敏实验
选用赛福康、环丙沙星、妙富、阿莫西林、诺氟沙星、红霉素、链霉素等抗菌药物，采用常规纸片法进行药敏试验。
1.5防治
1.5.1 发病后的紧急措施 1 采取隔离措施：隔离病鸡及可疑的鸡，将其隔离到大鸡群接触不到的地方，封锁鸡舍。将病鸡及时挑出进行隔离饲养或淘汰并做好消毒工作。2加强饲养管理，改善鸡舍环境，及时清理粪便，加强通风换气，以降低有害气体的刺激，并达到稀释病原体目的。 3严格执行环境、饮水消毒工作，杀灭病原体，控制疾病蔓延。4立即检查鸡舍内小环境是否适宜，饲料、饮水、密度、温度、湿度等是否存在问题，如有则立即改正。5保证鸡的采食量，若采食量不足，增加饲料中的营养浓度，并在饲料或饮水中添加加奇，以增加机体抗病力。
1.5.2 治疗方案及用药 用赛福康+感康或妙富+感康饮水，每天一次，连用5天。
2 结果与分析
2.1 初步诊断
根据流行病学，临床症状及剖检变化初步诊断为鸡支原体与大肠杆菌的混合感染。
2.2 实验室诊断结果
2.2.1 病料涂片观察结果 经革兰氏染液染色的抹片在视野中观察到两端钝圆、单个或成双存在的革兰氏阴性短杆菌。经姬姆萨染色液染色的抹片，视野中可观察到形态、大小不一紫红色菌体。
2.2.2 细菌分离鉴定及纯培养结果 分离鉴定结果：经革兰氏染液染色的抹片在视野中观察到两端钝圆、单个或成双存在的革兰氏阴性短杆菌。经姬姆萨染色液染色的抹片，视野中可观察到形态、大小不一的紫红色菌体（呈卵圆形、球形、杆状，也有呈丝状、环状）。经纯培养后菌落特征见表 1
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革兰氏染色图片
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姬姆萨染色
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伊红美蓝琼脂培养基
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SS培养基
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PPLO琼脂培养基
表1各培养基上菌落形态特征
培养基 培养时间 (h) 结果
普通肉汤 24 肉汤均匀混浊，管底有粘性沉沉，表面有菌环
普通琼脂培养基 24 边缘整齐，表面光滑、湿润、低而隆凸的无
色菌落
麦康凯培养基 24 粉红色菌落
伊红美蓝琼脂培养基 24 深紫色、隆凸、表面湿润、发有蓝绿色金属光泽
S.S琼脂平板 24 红色
PPLO琼脂培养基 120 在低倍（40 倍）显微镜下检查有菌落生长，形成微小的光滑而透明的露珠状菌落，直径约0.2～0.3mm，菌落中央有颜色较深且致密的乳头状突起。
从表1可知鉴别培养基上所得菌落特征与大肠杆菌的菌落特性一样，鸡血清培养基上的菌落特征与鸡毒支原体在该培养基上的菌落特征一致。
2.2.3 生化试验结果 从, 纯培养基上钓取特征性单个可疑菌落接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、靛基质、MR、VP、硫化氢、 枸橼酸盐、明胶、硝酸盐、尿素酶等生化培养基上，其结果见表 2
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表2生化试验结果
注：⊕表示产酸产气；-表示阴性；+表示能利用或阳性；⊕/X表示发酵迟缓。
项目
Head
葡
萄
糖
乳
糖
麦
芽
糖
蔗
糖
甘
露
醇
靛
基
质
M
R
V
P
硫
化
氢
枸
橼
酸盐
明
胶
硝酸盐
尿
素
酶
结果
Results
⊕
⊕
⊕/X
⊕
⊕
+
+
-
-
-
-
+
-
从表 2 可知分离纯培养得到的细菌完全符合大肠杆菌的生化培养特性，表明该细菌是大肠杆菌。
2.2.4动物回归试验 动物试验结果显示，试验组24～72h全部发病，72～96h死亡7只，对照组的鸡全部健活。因此可知，分离到的是致病菌株。用经纯培养基上的细菌肉汤培养物，给2周龄雏鸡皮下接种0.5ml。24h内死亡的雏鸡无明显病变，但是，从肝脏中分离到了本菌；72h以后死亡的雏鸡，不仅从肝脏中分离到本菌，而且见到了不同程度的心包炎、肝周炎等病理变化，且死亡雏鸡的组织触片、染色、镜检及划线接种，分离到了与接种菌完全一致病原菌，临床症状一样。
2.2.5平板凝集试验结果两分钟后出现清晰可见的蓝色凝块，呈阳性反应 ，表明该鸡群感染了鸡毒支原体。
2.3 综合诊断结果
通过实验室诊断中的细菌形态观察、鉴别纯培养、生化试验、动物试验确诊为两端钝圆、单个或成双存在的革兰氏阴性短杆菌是致病性大肠杆菌。通过菌落特征、平板凝集试验阳性确诊为鸡毒支原体感染。因此，该病为大肠杆菌和鸡毒支原体的混合感染。
2.4 药敏试验结果
药敏试验结果见表 3。
表3 药敏试验结果
药物名称
病原菌
妙富
赛福康
阿莫西林
诺氟沙星
红霉素
链霉素
环丙沙星
抑菌环直径
大肠杆菌
支原体
16
19
17
16
12
7
10
8
8
13
7
3
9
13
注：判定标准：抑菌圈直径9mm以下为耐药，10～15mm为中敏感，16mm以上为高敏感
从表 3 可以看出大肠杆菌对赛福康、妙富高度敏感，对阿莫西林、诺氟沙星为中度敏感，红霉素、链霉素、环丙沙星耐药。鸡支原体对妙富、赛福康高度敏感，对红霉素、环丙沙星为中度敏感，对阿莫西林、诺氟沙星、链霉素耐药。
2.5 防治结果
以上药物治疗5天，鸡只死亡数降低，大鸡群精神、饮食基本恢复正常，病情得到控制。
3 讨论
3.1 发病原因的探讨
首先是支原体病原存在的广泛性。由于我国一般种鸡场都不做支原体阳性鸡的淘汰工作，父母代或多或少都有支原体阳性鸡，凡是带有支原体的种母鸡，它的后代一般都带菌。种蛋在孵化过程中的每一环节都可能直接或间接的感染支原体，使雏鸡带菌；也可在同一鸡群内由带菌鸡接触健康鸡。因此，商品肉鸡的支原体阳性率一般都比较高。但是，并非感染支原体的鸡都会发生该病，许多鸡仅是隐性感染而不表现临床症状，但应激因素会降低鸡只的抵抗力而继发本病。可以说，凡是引起鸡体不适并形成体内复杂的防卫反应和损害变化的应激因素都可诱发该病的发生。因此，应激是导致发生本病的最主要原因，尤其是鸡舍通风不良、拥挤、潮湿、过冷过热、有害气体浓度高，接种, 疫苗或发生其他疫病是诱发该病的最主要原因。
第二是在集约化的高密度饲养环境下，随着肉鸡的快速生长和新陈代谢愈来愈旺盛，鸡舍饲养环境很快被污染，舍内不断产生各种对鸡有害的物质，如各种尘埃、病原微生物、内毒素、有害气体等，会长期在鸡舍空间飘荡。鸡舍中有害气体主要有氨气、硫化氢、二氧化碳、一氧化碳等，其中氨气的影响尤为明显。病原微生物粘附在很小的尘埃颗粒上被吸入呼吸道，附着在气管粘膜上，进一步破坏粘膜细胞，并大量繁殖和蔓延，同时病原微生物会跟着受侵犯的淋巴细胞进入血液中，进入其他脏器和组织，造成炎症，机体免疫力下降，使鸡表现出严重的不良反应。
3.2 鉴别诊断
该病与传染性鼻炎、传染性喉气管炎、传染性支气管炎，曲霉病相类似，但是在流行病学、临床症状、病变特征等是有差别的，现将鉴别要点列举见表4：
表4 慢性呼吸道病、传染性鼻炎、传染性喉气管炎、传染性支气管炎，曲霉病的鉴别
病名
慢性呼吸道
CRT
传染性鼻炎
IC
传染性喉气管炎ILT
传染性支气管炎IB
曲霉病
病原
鸡毒支原体
副嗜血杆菌
疱疹病毒
冠状病毒
烟曲霉菌
自然感染
鸡和火鸡
鸡
鸡
鸡
鸡、鸭、鹅
流行病学
主要侵害4~8周龄肉鸡，呈慢性经过，可经蛋传播
3~4日龄幼鸡有抵抗力，4周龄以上的鸡均易感，呈急性经过
主要侵害成年鸡，传播迅速，发病率高
各种年龄的鸡均可发病，但雏鸡最严重，传播迅速，发病率高
各种禽类都可发病，幼禽易感
主要症状
流浆液或黏性鼻液喷嚏，呼吸困难，出现罗音；后期眼肿胀
流鼻液，喷嚏，脸部和肉髯水肿；眼结膜发炎，眼睑肿胀
呼吸困难，呈现头颈上伸和张口呼吸的特殊姿势，呼吸罗音，咳嗽
咳嗽喷嚏，张口呼吸，呼吸罗音，鼻窦肿胀流黏性鼻液；
沉郁，呼吸困难，气喘肉髯发绀，饮水增多常有下痢，鼻和眼睛发炎出血性黏液
病变特征
鼻，气管，支气管和气囊内有黏稠渗出物，气囊膜变厚和浑浊，表面有结节性病灶，内含干酪物
鼻腔和鼻窦黏膜卡他性炎症，表面有大量黏液；严重时鼻窦和眶下窦和眼结膜囊内有干酪样物
轻者，喉头和气管黏膜呈卡他性炎症；重者，喉头和气管黏膜变性、出血死，上面覆有纤维素性干酪样假膜，气管内有血性渗出物
鼻腔，鼻窦，气管支气管黏膜呈卡他性炎症，有浆液性或干酪样渗出物
肺、气囊和胸膜腔浆膜上有针帽至小米大小的灰白色或淡黄色的霉斑结节，内含干酪样物
3.3防治措施
3.3.1 引进支原体阴性或阳性率很低的种鸡生产的雏鸡，从根本上杜绝或防止雏鸡发生支原体感染。
3.3.2 从进鸡前就要做好鸡舍内环境的清扫、清洗和消毒工作，在养鸡过程中尤其是雏鸡阶段，做好严格的防疫隔离和消毒措施，用安全性好的季铵盐类等消毒液每周2～3次喷雾消毒，以降低粉尘中支原体及其它微生物对呼吸道的刺激和损伤作用。但应注意疫苗免疫前后2～3天不要进行喷雾消毒。
3.3.3 提供适宜的温、湿度及良好的通风换气至关重要。降低舍内氨气浓度，管理好饮水器，防止漏水；
3.3.4 尽量减少、消除引起呼吸道病的诱发因素，如气候突变、过冷过热、鸡群密度过大、营养不良、不正确的免疫方法及通风不良等都会诱发或加重呼吸道病，可以说，控制好环境因素是防止复合型呼吸道病发生的最直接的措施。
3.3 .5 很多呼吸道症状往往是由新城疫病毒和传支病毒与大肠杆菌、霉形体共同作用的结果，因此，必须先做好病毒性传染病的免疫预防。第一次免疫预防最好选择能突破母源抗体且对雏鸡没有病原性的新城疫和传支二联疫苗，在7日龄前进行免疫，甚至可以提前到1～3日龄，及早接种疫苗，可在呼吸道和消化道的局部形成免疫力，因为在粘膜表面产生的IgA抗体可中和呼吸道病毒而起到局部免疫保护作用。因此，一定要重视鸡群呼吸道局部免疫力的产生，不要单看血清抗体水平；第二次免疫可用新支二联疫苗在首免后的14天进行，用以加强免疫，这样保护力可持续至出栏。
3.3.6 选择敏感性高的抗菌药物控制霉形体和大肠杆菌的继发感染。实际生产中很多应激因素难以避免，如运输、免疫、气候突变等，因此使用相应药物控制和预防非常必要。
3.4 要想使该病得到很好的控制必须采取综合的防治措施、建立、建全生物安全体系。在治疗方面，大肠杆菌是极易产生耐药性的病原体。目前，随着抗菌素广泛使用，特别一些养鸡户将抗菌素饲料添加剂使用，耐药菌珠日益增多，这给治疗带来一定的困难。因此，在治疗时应先进行病原分离和药敏试验，选取敏感的药物和用足剂量，严格控制好环境条件，方可获得满意的效果。
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