哪种禽流感冠状病毒疫苗株将在中国成为主要流行株？
传染性支气管炎病毒（IBV）是家禽养殖场的重要病原体，可引发呼吸道、肾病理学、输卵管、前胃和肠道疾病。根据全长S1基因的系统发育分类，IBV分离物已被划分为包括38个谱系的九个基因型。在过去的60年中，中国已报道了GI（GI-1、GI-2、GI-3、GI-4、GI-5、GI-6、GI-7、GI-13、GI-16、GI-18、GI-19、GI-22、GI-28、和GI-29）、GVI-1和GVII-1。本综述介绍了中国IBV的简要历史，并突出了目前的流行株、已获许可的IBV疫苗株，以及IBV的预防和控制策略。此外，文章提出了对IBV更有效管理的独特观点和建议。表达IBV QX样和4/91株S基因的重组新城疫病毒（NDV）载体疫苗可能成为对抗NDV和IBV的主导疫苗株。1、动物冠状病毒简介
自2019年冠状病毒病（COVID-19）爆发以来，截至2022年12月7日，根据世界卫生组织网站，全球已有超过6.42亿例确认病例和6.6百万例由冠状病毒感染导致的确认死亡病例。自首例确认病例公布以来，COVID-19大流行已经持续了近3年，该病毒导致了全球范围内的显著经济损失（1）。为了应对这一病毒，科学家和卫生工作者展现了他们的专业素养。从最初的病例护理到当前的疫苗免疫，越来越多的国家将在疫苗接种率超过85%时考虑开放边界，表明疫苗免疫仍然是预防冠状病毒感染的关键技术。
动物冠状病毒一直备受关注，有一些重要的冠状病毒严重危害牛群和家禽业经济，例如猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪Delta冠状病毒（PDCoV）、犬冠状病毒（CCoV）、猫冠状病毒（FCoV）和禽传染性支气管炎病毒（IBV）（表1）。尽管第一个冠状病毒是在1930年代发现的，但在2002年至2003年间，由SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸综合症（SARS）大流行在许多国家和地区席卷，引发了广泛的社会恐慌，冠状病毒因此引起了广泛关注（2）。在此之前，对冠状病毒的研究主要限于兽医领域。禽传染性支气管炎病毒在鸡中具有极高的传染性，是导致严重呼吸系统障碍的主要原因，并在中国家禽业中构成重大威胁。表1.主要的动物冠状病毒。
注：BCoV，牛冠状病毒；ECoV，马冠状病毒；CrCoV，犬冠状病毒；MHV，小鼠肝炎病毒；PHEV，猪血凝病毒；BWCoV-SW1，白鲸冠状病毒SW1；CMCoV，普通水鸡冠状病毒。
IBV属于冠状病毒的γ群。其完整基因组约为27.6kb，由5′-1a-1b-S（S1、S2）-3a-3b-3c（E）-M-5a-5b-N-Poly(A)-3′从5′端到3′端组成（3）。IBV基因组编码四种结构蛋白，即刺突蛋白（S）、小包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣蛋白（N）。在这四种结构蛋白中，S蛋白包含IBV的主要保护性抗原表位，并能刺激机体产生中和抗体。同时，S蛋白在病毒吸附到细胞的过程中也发挥着至关重要的作用，因此在一定程度上决定了病毒对组织的病毒学亲和性（4）。S蛋白的C端的一小部分埋入包膜膜中，其余部分位于包膜膜外形成病毒刺突。S蛋白由氨基酸N端的S1和氨基酸C端的S2组成，它们分别由520和625个氨基酸组成，并通过二硫键连接（5, 6）。此外，S1蛋白有三个与IBV血清型密切相关的高度可变区，表明S1基因核苷酸是IBV基因分型的主要决定因素。
2、中国禽传染性支气管炎病毒（IBV）历史
禽传染性支气管炎病毒（IBV）首次于1931年在美国被描述为鸡的呼吸道疾病。1965年，世界上首个人类冠状病毒被从患有普通感冒的患者的鼻分泌物中分离出来。1975年，冠状病毒正式被国际病毒命名委员会（现在更名为国际病毒分类委员会（ICTV））命名为冠状病毒科，目前根据病毒血清学特征和核苷酸序列差异，冠状病毒科被划分为两个属，即冠状病毒属和圆环病毒属。像严重急性呼吸综合症冠状病毒（SARSV）、禽传染性支气管炎病毒（IBV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）等常见的重要冠状病毒属于冠状病毒属。
IBV在中国已存在60多年（图1）。1958年，IBV爆发在中国台湾省。TW-I和TW-II基因型于1990年代初首次被鉴定，并被认为是明显不同的基因型。1972年，IBV首次在中国大陆的一家家禽养殖场报道。随后，IBV迅速成为家禽业中最重要的病原体之一。根据IBV的组织病毒学亲和性，最初将IBV分离株分类为肾病理学、输卵管、前胃或肠道类型。随着分子生物学技术的进步，根据全长S1基因的IBV分离株系统发育分类开始被划分为包括38个谱系的九个基因型，并且基因型已成为IBV分离株分类的最常用方法。基因型I包括30个不同的病毒谱系（暂命名为GI-1至GI-30），而其他基因型每个都由一个病毒谱系组成（GII-1、GIII-1、GIV-1、GV-1、GVI-1、GVII-1、GVIII-1和GIX-1）。
基因突变和重组（特别是在S1基因中）可能导致变异或新的基因型产生。过去3年中许多SARS-CoV-2变异株的出现告诉我们包括IBV在内的所有冠状病毒具有快速的突变速率，可能引发新的病毒类型的出现，具有导致疾病的潜力。由于中国独特的地理地貌和气候环境的巨大差异，以及中国南北部的不同养殖品种和养殖方式，IBV的流行特征在不同时间和地区变化，中国存在多种IBV基因型和变异。GI（GI-1、GI-2、GI-3、GI-4、GI-5、GI-6、GI-7、GI-13、GI-16、GI-18、GI-19、GI-22、GI-28和GI-29）、GVI-1和GVII-1在过去几年中已在中国报道。在这些报道的病毒谱系中，更具代表性和重要的基因型是QX（GI-19）和4/91（GI-13），它们是中国的主导谱系。据报道，从2019年4月到2020年3月，南部地区分别分离出93株QX株和19株4/91株，分别是南部地区的第一和第二流行株。此外，TW（GI-7）和SAIBK（GI-22）偶尔在一些地区引发流行病。GI-28、GI-29和GVII-1是近年来分离的新基因型（图2）。
1996年，青岛的病鸡群中首次分离出腺胃型IBV QX株，1999年，新疆的病鸡中分离出代表性株LX4，与韩国的肾病理学分离株KM91具有高度的核苷酸相似性。后来，发现了许多类似QX株的IBV株，并成为中国的主要流行株。2001年，类似的病毒在东欧以及包括英国在内的其他欧洲国家报告。由于其广泛的流行和分布以及与疫苗株和野外株的重组，QX样型IBV作为GI-19群的一员，如今代表全球最重要的IBV基因型之一。从注射H120和4/91疫苗的鸡中分离出的新型低毒性呼吸IBV ck/CH/LJX/2017/07（简称JX17）被证明是QX、TW和4/91基因型株的重组株。高毒性QX样IBV株CK/CH/JS/TAHY显示出典型的临床症状，包括咳嗽、鼻液流出以及肾损伤伴有严重的尿酸沉积。新型QX样IBV株不仅可以从严格的免疫方案下的密集家禽养殖场中分离出，而且还显示出各种临床症状，表明基于组织病毒学亲和性难以区分变异株。
首个已知的4/91（也称为793/B和CR88）血清型分离株于1985年在法国分离，然后于1990年冬季进入英国。随后，这个血清型在欧洲大多数国家以及世界许多其他地区广泛流行，但其结构和抗原性似乎没有发生显著改变，因为最初设计的疫苗仍然提供有效的免疫力。2003年，中国首次分离出4/91血清型株，病毒分离物被命名为泰安-03（也叫TA03）。此后，4/91血清型病毒株在中国被发现并正在扩散。更重要的是，4/91疫苗和野外株参与的基因重组导致了一些新的株的出现，进一步增加了传染性支气管炎病毒的遗传多样性和复杂性。新的GI-28分离株CK/CH/SCMY/160315被发现是由弱毒活疫苗株H120（GI-1）、4/91（GI-13）、LDT3-A（GI-28）和野外株LJL/08–1（GI-19）的多重重组株。类似地，IBV株ck/CH/LHLJ/140906也是来自母本IBV株4/91和H120的天然重组株。先前的研究显示，4/91型株更容易发生重组，因此应谨慎或谨慎使用4/91型疫苗。
图1.中国传染性支气管炎病毒（IBV）历史上的主要代表性事件。
图2.基于IBV S1基因核苷酸序列分析的遗传进化树。该树是使用MEGA 11.0软件采用邻接法构建的。143个IBV参考株的S1基因序列被聚类成GI-GIX基因型，其中包括30个GI谱系。所有中国的分支线均突出显示。
TW基因型是一种重要的基因型，最近开始成为中国大陆最常见的基因型之一。IBV台湾株被分为TW-I和TW-II基因型，并分组为相同的谱系GI-7。由于台湾和中国大陆之间的地理隔离，IBV台湾株在进化上与中国大陆的IBV分离株有明显差异。TW-I基因型株自1990年后在中国大陆频繁分离，表现为经典的肾炎症状。TW-II基因型株表现出呼吸系统症状，在1990年代之前分离自台湾中国，现在在中国大陆很少分离到这种基因型病毒。自2009年以来，TW-I基因型IBV在中国大陆的流行程度从7.5%（2009–2010）增加到27.4%（2013–2015）。值得注意的是，由于广泛疫苗接种和近距离选择性压力的影响，TW-I基因型在中国的广东、广西和福建三个南方省份中占主导地位。
在中国，Genotype I IBV中新增了两个新的血清型。IBV株ck/CH/LGX/111119在S1序列分析和病毒交叉中和试验结果基础上，被发现在遗传和抗原学上与其他已知的IBV类型不同，并被命名为GI-28。它是一种肾病理学株，具有更广泛的组织亲和性，可能是LX4基因型（GI-19）和尚未鉴定的IBV的重组体。随后，在中国的不同地区分离出了许多GI-28基因型的IBV株，如CK/CH/SCMY/160315株和GX-NN-13。另一种新的基因型（GI-29）IBV株，包括γCoV/ck/China/I0111/14、γCoV/ck/China/I0114/14和γCoV/ck/China/I0118/14，是从中国南方的广西分离出的三株肾病理学株。
GVII-1基因型是中国的另一种新型IBV谱系。GX-NN130021株是从2013年广西省疑似IBV阳性的21天龄病鸡中分离出的，这些病鸡接种了H120疫苗，并被确定为新型I 。对中国2016年1月至2017年12月的禽IBV基因多样性的流行病学研究显示，根据S1基因完整核苷酸序列的序列分析，发现了一种高度同源的新变种I0636/16，与GX-NN130021株相似。直到2019年，根据详细的系统发育分析和序列比较，I0636/16和GX-NN130021株都被归为GVII-1基因型。同时，病毒交叉中和结果显示GVII-1在抗原上与当前的基因型谱系有差异。GVII-1基因型在中国已经循环了9年。
3、当前中国对抗IBV的预防和控制策略
目前，全球家禽养殖场中，使用弱毒或灭活疫苗接种仍然是保护鸡群免受IBV感染最有效的技术。除了全面的生物安全防疫措施外，制定适当的免疫方案对于预防和控制IBV感染至关重要。中国采用了多种类型的IBV疫苗，包括弱毒和灭活疫苗，以及单一和多重组合疫苗。此外，还存在许多类型的IBV疫苗株，如Mass、QX样和4/91样。
所有商业上可获得的IBV疫苗已根据国家基础兽药数据库总结在表2中。这些疫苗具有一些特点。首先，所有的单一疫苗都是弱毒的IBV疫苗株，分为三类：Mass（H52、H120和W93）、QX样（LDT3-A和HC13-91）和4/91样（NNA和FNO-55），这代表了中国目前的主要流行株。其次，NDV-IBV联合疫苗分为活疫苗和灭活疫苗两种，而灭活NDV-IBV联合疫苗仅包括两种IBV株，即M41（Mass）和Jin 13（QX样）。活疫苗NDV-IBV联合疫苗有多种基因型，包括H52、H120、QXL87、B48和LDT3-A。所有的三联和四联灭活IBV疫苗都源自同一种IBV疫苗株M41。总的来说，IBV和NDV通常一起用来制作联合疫苗。
表2.中国商业化IBV疫苗列表
注：NDV，新城疫病毒；IBDV，传染性支气管炎病毒；EDSV，蛋降综合症病毒；AEV，禽脑脊髓炎病毒。
尽管有许多疫苗可用，但存在许多占优势的IBV血清型株，这影响了疫苗的有效性。不同的IBV血清型之间只能引起有限的交叉保护免疫，因此经常报告疫苗免疫失败的情况。因此，预防IBV感染的关键是及时了解精确的本地流行株并选择适当的IBV血清型疫苗。
近年来，中国市场上的鸡的数量从2017年到2020年显著增加，截至2020年底达到150亿只（图3）。IBV偶尔在大规模养殖场和散养家庭中爆发。为了应对IBV免疫失败，可以实施一些控制病毒感染的策略。近期研究已验证了传统中医学（尤其是针灸），传统中医药（TCM）在抗击冠状病毒和流感病毒感染中发挥了一定作用。注册的兽医药物舌甘地龙制剂与多西环素的联合已被证明能预防IBV感染和肉鸡呼吸道损伤。中药草药金银花在细胞中对IBV感染有超过90%的抑制率，在SPF鸡中对IBV的挑战有超过50%的保护率。此外，经典方剂清瘟败毒汤通常用于治疗各种病毒性传染病，包括COVID-19和IBV，具有积极的治疗效果，尽管该汤剂尚未正式批准用于治疗COVID-19。在中华人民共和国兽医药典中记录的甘草颗粒、止咳散、板青颗粒、金花平喘散、定喘散、银翘散等许多中药制剂可用于预防和治疗IBV感染。对于不给鸡接种疫苗、不仔细执行生物安全预防措施以及不严格遵循消毒方案的家禽养殖户，中药制剂在减少经济损失方面发挥着关键作用。
图3.2017年至2020年中国上市鸡的数量。
4、对更好控制IBV的前景和建议
毫无疑问，中医在中国一些家禽养殖场中对抗IBV感染发挥了重要作用。然而，对于未来高度密集、产业化、自动化和智能化的大规模养鸡场，疫苗免疫仍然是未来的趋势。面对IBV复杂多变的流行株，我们需要做的是研发更好的疫苗，实施更有效的免疫接种策略，并制定更优化的免疫方案。
4.1.更好的IBV疫苗
目前，中国IBV经典弱毒和灭活疫苗存在一个重要问题。问题在于新型经典疫苗的研发速度赶不上IBV病毒的变异速度。随着变异株和新血清型IBV的逐渐增多，经典疫苗无法为鸡提供足够的免疫保护，防范IBV感染。为了对抗IBV感染，迫切需要研发新型IBV疫苗。对于新型IBV疫苗，它不仅应避免与野外病毒株进行基因重组，还应为流行株提供足够的保护。下一代疫苗应该能够对抗未来的大流行病毒，并提高对IBV变异的长期保护。基于信使RNA（mRNA）的疫苗、病毒载体疫苗和亚单位疫苗可能是未来的研究方向。
COVID-19大流行引起了全球人们对mRNA疫苗的关注。截至2022年11月15日，世卫组织报告了371种正在研发的COVID-19疫苗候选，其中65%是mRNA疫苗，其中40%已进入临床试验，表明mRNA在预防IBV感染方面具有潜在的未来。与弱毒和灭活疫苗等经典疫苗相比，mRNA疫苗具有许多优势，包括短的研发周期、易于产业化、简单的生产工艺、对新变异的灵活响应以及诱导更好免疫反应的能力。Brenner及其同事在1961年首次报告了mRNA分子，由于mRNA分子高度不稳定且容易降解，直到1984年首次成功使用SP6 RNA聚合酶体外转录和合成mRNA，为进一步的体外mRNA研究奠定了基础。1990年，体外转录mRNA首次被注射到小鼠肌肉中成功表达。然而，由于不令人满意的稳定性和安全性，mRNA疫苗一直受到广泛忽视。直到2005年，新的脲基核苷酸修饰被应用于合成mRNA，以改善mRNA在体内的稳定性和免疫原性。2018年，patisiran，第一个RNA干扰治疗药物，被许可并用于治疗成年人遗传性转甲状腺激素介导的淀粉样蛋白沉积病的多发性神经病变。直到2019年COVID-19大流行开始，mRNA疫苗成为当前的研究热点，mRNA疫苗辉瑞-联发科（BNT162b2）和莫德纳（mRNA-1273）获得了许多国家和地区的紧急使用授权，如美国、英国等。然而，在IBV mRNA疫苗问世之前仍然有许多问题需要解决。目前，mRNA疫苗面临的最大问题是冷链储存。全球最广泛使用的两种mRNA疫苗在灌装到接种前都必须在极具挑战的超低温环境中储存和运输。辉瑞/BioNTech疫苗需要在−80°C到−60°C之间的极低温下储存，解冻后在室温下只能稳定2小时；莫德纳疫苗稍微稳定，但仍需在−20°C储存。严格的储存条件限制了疫苗的远距离运输，极大地增加了疫苗的运输和储存成本，实际上推高了疫苗本身的价格，最终导致在发展中国家推广疫苗变得困难。已经设计了更多新的配方来确保mRNA疫苗的稳定性，例如辅料的选择、配方环境和制造过程。一些冻干的mRNA疫苗可以突破mRNA疫苗储存和运输的技术难题。因此，对于动物（尤其是禽类冠状病毒）的mRNA疫苗是可行的，值得期待。
与mRNA疫苗和亚单位疫苗相比，病毒载体疫苗对IBV的商业化和在养禽场中的使用最有可能率先实现。已经有人类和动物成功使用病毒载体疫苗的例子。在中国，已注册的商业病毒载体疫苗主要包括毒囊病-马尔克病活体马尔克病载体疫苗和马尔克病、传染性囊病HVT载体疫苗。灭活重组杆状病毒疫苗是牲畜唯一的病毒载体疫苗，包括猪圆环病毒2型、貂瘟细小病毒和兔出血性病毒。此外，病毒载体疫苗最大的好处是单一疫苗可能对两种传染病提供保护，同时诱导体液和细胞免疫，而其他两种疫苗均无此能力。许多类型的病毒载体可供选择，已经报道了禽类的多种病毒载体，如新城病毒（NDV）、禽腺病毒（FAdV）、火鸡疱疹病毒（HVT）。每种病毒载体疫苗都有其优势。在NDV、FAdV和HVT病毒载体中，NDV在三个方面可能是IBV最佳的病毒载体。首先，在养禽场中，通常同时接种IBV和NDV，这就是为什么所有注册的IBV联合疫苗都含有NDV疫苗的原因，其中大多数是LaSota株（表2）。与FAdV和HVT病毒载体相比，NDV疫苗在养禽场中被广泛使用，NDV病毒载体适用于NDV和IBV的同时免疫。其次，不致病的NDV LaSota株作为疫苗载体在安全性和有效性方面具有悠久的记录，可以诱导强烈的局部和全身免疫反应对抗外源性抗原。第三，基于NDV的逆向遗传技术平台，可以快速开发针对当前流行IBV株的病毒载体疫苗，并可以避免弱毒病毒疫苗与野外株之间的基因重组的缺点。表达IBV抗原的重组NDV载体疫苗将从优化疫苗免疫方案、安全性和有效性以及疫苗研究的及时性等方面受到鸡场的欢迎。
目前，中国家禽唯一的基因工程亚单位疫苗是传染性囊病病毒亚单位疫苗。对于猪，有几种已注册的亚单位疫苗，包括猪瘟、猪圆环病毒2型、链球菌和猪嗜血杆菌混合疫苗。此外，还有一种针对鸽弓菌的绵羊重组亚单位疫苗。总体而言，研发IBV亚单位疫苗需要克服许多困难。由于在体外制备的纯化病原体蛋白难以保持稳定的蛋白结构表位，因此无法产生持续而稳定的免疫应答。免疫应答通常仅影响体液免疫，无法激活细胞免疫。因此，亚单位疫苗的剂量增加，间接提高了养禽场的劳动成本。此外，蛋白提取和纯化的生产方法直接提高了亚单位疫苗的生产成本。因此，这一费时费力的亚单位疫苗并非生成新型IBV疫苗的最佳方法。
4.2.新的接种途径
呼吸黏膜免疫在预防呼吸道疾病，尤其是冠状病毒感染方面发挥着重要作用。经气雾腺病毒5型载体的COVID-19疫苗（Ad5-nCoV）已在临床试验中评估，并显示出良好的中和抗体反应。同时，许多养禽场主选择采用气雾吸入的方式在雏鸡孵化时对其进行新城疫和传染性支气管炎联合疫苗的免疫。与常规接种途径相比，雾化免疫具有很多优势，包括劳动强度极低，以及高黏膜免疫。黏膜免疫能够诱导高分泌免疫球蛋白IgA，这是一种抗感染免疫的重要屏障，对防止病原体在黏膜表面的附着和入侵、溶解细菌以及中和病毒和毒素方面产生强大的作用。雾化设备、飞沫大小和疫苗佐剂是影响雾化免疫的三个主要因素，下一步的研究方向是确定如何改进这三个特性。
鸡，尤其是肉鸡/繁殖母鸡和蛋鸡，每只鸟在一个生产周期内平均接种12-20次疫苗。为了减轻疫苗免疫带来的应激并避免母源抗体的干扰，卵内接种可能是一种可行的免疫途径。卵内接种是在18天龄胚胎鸡蛋中进行的，正好与鸡蛋从孵化器转移到孵化室的过程相一致，现在已经成为全球普遍采用的常规操作。与粗喷雾或水接种不同，卵内接种确保每只鸡都能接种到精确、均匀分布的疫苗。更重要的是，卵内接种可以引发一日龄雏鸡对循环病原体的早期免疫反应，而后孵化接种则不具备这一点。因此，卵内疫苗针对IBV联合NDV是可行的，尽管需要考虑一些问题，包括疫苗株对鸡蛋的毒力、一些疫苗可能引起的母源抗体干扰和免疫抑制。
4.3.更优化的免疫计划
为了预防和管理传染性支气管炎病毒（IBV），一个合理和科学的免疫方案至关重要。在为鸡场设计免疫计划时，至少应考虑以下几个因素。首先，注意本地IBV的流行程度和严重程度。然后，评估通过免疫疫苗诱导的母体抗体和免疫反应。此外，选择合适的可用IBV疫苗，并确保疫苗接种途径和频率。最后，考虑IBV疫苗对其他疫苗和动物健康的影响。
IBV有许多血清型，单一血清型的IBV疫苗接种无法对抗异源性挑战。因此，农民使用多种疫苗血清型来扩大家禽群体的保护范围，这一实践被称为“多价单独”。由于这种策略在实践和原理上的有效性，已在全球范围内的家禽养殖场得到应用。随着新的IBV血清型和变种的不断出现，Mass型和793/B型IBV血清型已被证明是广泛使用的疫苗类型，具有最大的交叉保护广度。在中国，有大量Mass型疫苗，并且商业化的793/B型IBV疫苗直到IBV NNA疫苗填补了2018年4/91型疫苗市场缺口之后才获得了临床使用批准，这为农民提供了使用这种策略的机会。
5、结论
如此庞大的中国家禽存栏规模为IBV基因突变和重组提供了便利。IBV感染仍然是一种重要的禽流感。疫苗接种已经取代了中医疗法成为鸡场的主要治疗方法，除了严格的生物安全措施。最佳疫苗株应该能够阻止IBV变异和重组的传播，同时对经典IBV株提供足够的保护。QX样和4/91样株是目前中国主要的流行株。根据疫苗的生产成本、接种途径和效果，表达IBV QX样和4/91样株的重组NDV病毒载体疫苗将成为对NDV和IBV的主导疫苗株。
参考资料：Li H, Liu G, Zhou Q, Yang H, Zhou C, Kong W, Su J, Li G, Si H, Ou C. Which strain of the avian coronavirus vaccine will become the prevalent one in China next? Front Vet Sci. 2023 May 5;10:1139089. doi: 10.3389/fvets.2023.1139089. PMID: 37215473; PMCID: PMC10196085.
来源：药时空，作者：Mr.Fang
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