【分享】我国家禽支原体感染现状与检测方法分析
01家禽支原体的病原学特点目前在家禽体内分离鉴定出28种支原体，可分为三组，其中非病原性支原体（占绝大多数），对鸡有强致病性的只有2种，鸡毒支原体M.gallisepticum和滑液囊支原体M.synoviae。
强致病性的支原体如MG、MS甚至可以像病毒一样入侵到细胞里面对其造成破坏。
支原体介于病毒和细菌之间，没有细胞壁，所以临床上一些针对于细胞壁的抗生素（如青霉素）对支原体没有效果。
支原体体外生长较为缓慢，培养要求很高，一般在体外需要培养7-10天才能看到生长。
MG和MS都只有一个血清型，但是不同菌株之间的基因的序列有所差异，致病性也有不同。
02支原体的症状及危害
MG可导致种蛋孵化率降低10%-20%，弱雏增加，弱雏死亡率5-10%；感染的肉鸡生长缓慢，饲料报酬率降低10-20%；蛋鸡开产日龄推迟2周；每羽每年产蛋量减少18枚，产蛋率降低10%-40%；且易与其它病原产生混合/并发感染。
MS也会造成孵化率下降，产蛋率下降约2-3%，弱雏死亡率5-10%；在肉鸡中多发于4周龄以上，最早2-3周发病，跛脚、生长迟缓；蛋鸡易发生胸囊囊肿、跗关节和趾部关节内乳酪色或灰白色脓性渗出液，后期形成胶冻样或干酪样物，死淘率高的达到3-5%。
部分毒株的支原体在蛋鸡中引起蛋壳尖端异常症(eggshell apex abnormalities-EAA)。
支原体也会造成免疫抑制（chen et al., 2020）。
03支原体的流行病学特点
支原体传播方式多样，既可以水平传播，也可以垂直传播。感染后几乎终生带菌，成为病原阳性带菌鸡。
支原体流行于世界各地的养鸡场，根据流行病学调查，感染率平均为70～80% 。
各种年龄的鸡均可被感染，但成年鸡较幼龄鸡的抵抗力高；不同品种的鸡抵抗力相似。应激因素可促进该病的爆发和流行。
04我国家禽支原体感染现状
王老师汇总整理了所在实验室从2020年3月到2022年9月的检测数据，发现所测样品中MG抗原核酸阳性率最高的是商品代肉鸡。
如果从日龄来看，6周后的阳性是最多的。早期感染（1-2周）也有，但检出率更低，但早期的感染可以基本判断为来自垂直传播。
MS自2010年最先从黄羽鸡开始爆发。2010年到2013年，我国鸡群MS病例数急剧增加。
2014年后扩散至全国，呈爆发流行趋势。
根据MS vlhA基因序列，MS可分为15种基因型（A-K）。我国鸡群MS分离株绝大部分属于K基因型（其意义有待研究），同时存在A基因型和E基因型。而不同部位的分离株，序列也存在差异。
MG/MS的第一个感染高峰在7-12周左右，第二个高峰在产蛋高峰阶段。
全国鸡群整体支原体感染率高，商品代白羽肉鸡MG感染压力较大，蛋鸡MS感染压力较大。祖代鸡感染率低，但存在两极分化的现象。
感染家禽支原体的鸡群普遍存在混合感染：支原体+IBV，支原体+CAV，支原体+大肠杆菌…
05家禽支原体检测方法分析
家禽支原体检测方法有病原分离、血清学检测和分子生物学方法等。
病原分离：可取气管或气囊的渗出物制成悬液，直接接种，加有醋酸铊和青霉素的支原体肉汤或琼脂培养基。
血清学方法：主要用于鸡群监测和怀疑有感染时的辅助诊断，常用技术包括血清平板凝集试验（SPA）、血凝抑制试验（HI）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。
分子生物学方法：PCR、荧光定量PCR、等温扩增技术、核酸分子杂交。
采样时，对于活禽，要采集鼻腔、口咽、食道、气管、眼、泄殖腔棉拭子样品；对于死禽，可采集鼻腔、气管、气囊、眶下窦或关节液等部位样品；而对于鸡胚，可从胚胎的卵黄膜内表面、气囊和口咽获得。
样品的运输也要格外注意。在运输过程中，需加冰袋或者其它制冷措施保持低温状态。
有多种用于分离培养的培养基，但最常用的是Frey’s培养基。分离成功后，可转接6-8 日龄SPF鸡胚的卵黄囊，保存超过24h死亡的鸡胚及尿囊液。
家禽支原体分离过程中要尽量无菌操作，控制细菌污染；培养基需含有在发病早期（急性期）采集样品，正确选择采样部位，规范操作；可对样品进行倍比稀释，因组织中存在抗体、抗生素等因子，可能抑制支原体增殖；支原体分离株的保存：冻干保存效果最好...
支原体种属的鉴定
家禽支原体的血清学检测方法
血清学检测方法是临床诊断支原体感染应用较广泛的方法，操作相对简单，主要应用于群体监测和血清学诊断的初步筛查。
有关禽支原体检测的血清学方法有：平板凝集试验（SPA）、血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）和琼脂免疫扩散试验（AGP）。
在直播过程中，王老师对这些方法的原理、优缺点和注意事项进行了详细的分析和讨论。
血清平板凝集试验结果
王老师特别提醒，血清学诊断只能测出鸡群群体的感染水平，并不能代表个体的感染状态！
家禽支原体的分子生物学检测方法
分子生物学检测方法操作简便，可直接检测样本中的病原核酸不需要进行病原分离，结果准确，但可能存在一定比例的假阳性和假阴性。
常用的分子生物学方法：聚合酶链式反应（PCR）、荧光定量PCR、等温扩增技术等。荧光定量PCR比PCR具有更高的灵敏度和准确性。
在进行PCR操作时，要避免气溶胶污染。需要对实验室进行核酸污染评估。如果存在核酸污染，需要采取一系列的消毒措施，直至实验室核酸污染监控为阴性。
如何避免假阴性？
王老师认为关键在于采样时机、采样方式与部位、检测方法/试剂盒的选择、以及阴、阳性对照的设置。
06家禽支原体检测方法的综合应用
实际生产中，单靠一种方法难以了解鸡群真实情况，因此往往需要综合应用多种检测方法得出结果，并对结果进行科学的对比和分析，最终才能形成可靠的决定（如用药或者免疫）。
在应用ELISA监控场区支原体感染状况时，应建立属于自己的基准线。基于长时间对数据积累和处理的经验，能够有效地分析结果。
偏离基准线的值提示鸡群生产环境中的变化。较基准线低的滴度值可能表明疫苗接种方式有误或免疫失败。较基准线高的滴度值可能说明鸡群正面临感染压力。
针对不同疫苗产生的抗体，王老师给出了参考滴度（免疫后6周）：
[*]F株：<3000；
[*]TS-11：1000-2000；
[*]6/85：<1000；
[*]R株（灭活）：6000-8000
07问答环节 Q&A
1. 问：能不能用平板凝集的方法去检测免疫效果？
王：平板凝集的灵敏度远远高于ELISA，免疫活疫苗后是可以进行平板凝集去检测的，但相关的研究较少。平板凝集容易产生非特异性反应，注意设置阴性对照。
2.在家禽农场里面出现支原体感染，最常见的传播途径是什么？
王：我们一般认为有三条：水平传播、垂直传播或者极少可能发生的疫苗传播（发生污染）。垂直传播比例较少，但因为是早期感染所以危害巨大。我个人认为，在目前的防控中，水平传播是更为重要的关键点。
3. 问：如果发生了垂直传播，鸡苗买来就被感染，到全群全部阳性大概需要多久？
王：因为影响因素比较多，所以不同的场区和鸡群可能差异比较大。
4. 问：MS会不会在特定的日龄更加易感？
王：如果雏鸡带有母源抗体，母源抗体大概可以维持3-4周的时间。母源抗体消失后的4周左右容易发生感染的阶段。但感染不代表发病，如果管理得当，鸡群往往不表现出症状，但却会不断排毒。在一些应激之后，如转群、免疫等，支原体会被激发鸡群开始发病。
5. 问：培养支原体时，培养基变黄之后就能说明有支原体生长吗？
王：如果出现杂菌污染，培养基也会变色，但同时也会变浑浊，而且变色的时间更短。另外一些MS/MG之外的支原体也会被分离到，它们也会使培养基变色。所以一般在分离之后进行鉴定来确认。
6. 问：支原体亚单位疫苗有用吗？
王：针对亚单位疫苗研究很多，但是真正应用到生产上的其实并不多。主要原因是有不同的病原有不同的免疫保护机制。亚单位疫苗免疫可以诱导机体产生针对特定蛋白的抗体，但对于支原体来说仅靠体液免疫产生抗体是不够的，我们还需要诱导鸡产生足够的粘膜免疫和细胞免疫。
7. 问：感染了MS之后，一般在多久会出现腿病？
王：实际生产中，MS造成的症状和鸡群状态、感染毒株等都有关系。实验室攻毒的情况下，一般三周可以看到腿病。一般腿病发生后，再去用药治疗往往已经太晚了。为了达到理想的效果，一定要在感染的早期就用药。所以对鸡群定期进行监测非常重要，把工作做在前面。
8. 问：有没有商品化的试剂盒，可以区分疫苗株和野毒株？
王：目前国内还没有，但很多生产商都在进行相关的研究。比如双重荧光定量PCR，可以同时检测MG和MS。支原体很容易发生变异和重组，所以即使针对特定毒株设计的PCR引物也很难100%确认。所以在设计检测方法的时候，要结合多种方法需检测，比如通用型的PCR、多位点检测、测序等相结合，避免错检漏检。
来源：poultry times，作者：王一新博士
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