【分享】鸡传染性支气管炎病的实验室诊断
介绍传染性支气管炎病毒(IBV)是一种具有高度传染性，流行范围非常广泛的病原微生物。它给家禽产业造成了严重的经济损失。防控传支的方法是生物安全与免疫相结合。但是该病毒的高度变异性使得新的变异株不断出现，进而导致防控失败。
不同基因型的传支变异株会可能引发各种不同的症状，需要使用不同的疫苗来预防。因此持续进行传支的流行病学监控，了解某一区域有哪些变异株在流行是非常必要的。
一个理想的IBV感染诊断方法， 应该快速、可靠且成本低廉。
如何选择最适宜的实验室检测分析方法？
由于IBV导致的临床症状没有证病意义，确诊传支病毒感染需要借助实验室检测手段。目前有多种诊断方法可供选择：病毒分离，血清学检测和分子生物学分析。应该根据诊断的目的来选择采用哪一种方法。
01病毒分离
病毒分离：将从田间采集的样品制成悬液，接种到SPF鸡胚中；继续孵化鸡胚；经过一定次数的传代，能够观察到IBV导致的鸡胚病变。也可以通过鸡的气管组织培养物(TOCs)来培养IBV。
样品可以采集自多种组织，这取决于以哪种症状为主。样品需要保存在0-4℃的条件下，并尽快送到实验室以保持病毒活力。当前病毒分离并不是确诊传支的常用方法，因为其耗时长，人工成本高，而且需要专业的设备。但是如果需要繁殖活病毒的话，还会采用这种方法。
02血清学检测
血清学检测主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和凝集抑制试验(HI)。血清学检测能够检测出IBV的特异性抗体，反映感染和免疫的状态。中等水平的抗体表示疫苗免疫情况正常；低水平的血清抗体则表示疫苗可能没有做好；而高抗体可能与田间野毒感染有关。图1展示了一个案例：在法国孵化厅免疫Cevac? Mass L 和 Cevac IBird?两种疫苗的多个鸡群的ELISA 抗体。
ELISA 分析无法区分抗体应答来自于哪个血清型，而HI却可以实现这一点。然而HI结果会受到多种田间野毒和疫苗毒共存状态的影响，这些毒株之间的抗体应答可能存在交叉。此外雏鸡存在母源抗体(MDAs) 会使得疫苗摄入情况变得更加难以分析。
03分子生物学技术
分子生物学技术（主要基于PCR 技术）是通过检测病毒RNA的方式来发现IBV的存在，现如今被广泛的应用于确诊IBV感染和评估疫苗免疫状况，从而间接评估免疫效果。PCR检测的一个特 点是能够确认病毒属于哪个基因型，这是确定免疫方案所需要的重要信息。另一方面PCR阳性并不意味着在采样的时候病毒是活的，或者正在发生感染。因此在解读结果时要特别注意这一点。
PCR 分析: 在选择了正确的采样方法和流程的前提下，是一种非常有效的传支诊断手段。
为了正确解读结果需要考虑的一些问题：
通用检测是以IBV基因组中一段通用的片段为检测目标，特定检测则是选择一个特定基因型的特定片段作为检测目标。
由于活疫苗被广泛用于田间免疫，而且在免疫后很长一段时间内都可以通过PCR检出。做通用检测时，大量的样品都会呈现出阳性，这样的结果是没有意义的（即使以病毒筛选为目的），因此很少被使用。针对某个基因型基因片段的特定检测，能够提供更有用的信息，但是这也意味着非此基因型的病毒不会被检出。
从另一个角度可以将RT-PCR分类方法分为常规RT-PCR和实时RT-PCR。常规RT-PCR完成后可接着做测序，进而获得更多检测到毒株的基因组的细节信息。而实时RT-PCR能够提供样品中病毒RNA的量化信息，但是却无法继续做测序。
常规RT-PCR加测序的方法能够检出几乎所有的IBV毒株并分析其特性。
不幸的是多种基因型共存（包括野毒和疫苗毒）的情况非常普遍。在这种情况下使用该方法，仅能检测出一个毒株（通常是优势毒株或者和引物最吻合的毒株）的序列。
在很多情况下，当多毒株共存时，不同的实验室采用不同的方法做出来的结果可能不同。出现这种结果是正常现象，接下来应该考虑如何正确的分析和解读结果。
PCR分析能够区分野毒和疫苗毒，因为它们的基因组不同。间接证据可作为辅助，例如检出的病毒属于一个并没有免疫过的基因型。差异可以基于基因进化树分析，或者是检出疫苗基因组中的一个特定的标记。
通过纵向研究来精确分析疫苗动力学
PCR的另一个作用是，通过纵向研究来精确分析在整个生产周期中疫苗的动力学。了解在哪个日龄疫苗滴度最高（通常在免疫后的7~10天），什么时候滴度开始下降。这对于评估疫苗的免疫程序非常有用。右图例子来自于Tucciarone等近期所做的研究。文章报道了在一日龄免疫Cevac IBird? 和 Mass 两种疫苗后疫苗毒的滴度变化(图 2)。由于不同的疫苗组合在免疫后所表现出来的病毒复制动力学不同，评估各种不同组合所产生的曲线是非常重要的。
纵向研究采取了高密度的采样程序，能检测出什么时间野毒会出现在鸡群中，帮助分析生物安全体系存在的缺陷。
适合用于PCR检测的样品，可以采自于口咽、气管、肾脏或泄殖腔。当怀疑感染，或在疫苗免疫后的5~7天检查疫苗摄入情况时，推荐采集口咽和气管样品。泄殖腔样品则用于检测某些在盲肠扁桃体复制和存在很长时间疫苗毒，注意这种排毒可能是间歇性的。
肾脏样品用于检测某些嗜肾性毒株，注意应该在发现肾脏病变时进行采样。在同一时间不同部位采集到的毒株可能是不同的，因为不同的毒株可能有不同的组织嗜性。因此从不同的部位采样进行检测分析，并不是在做重复工作。从尽可能获得更多信息的角度讲，这正是应该做的。
人们一般使用棉拭子采样，因为其程序简单，而且用于分子生物学分析的干拭子可以在不冷藏的情况下保存很几个星期。FTA卡也是很好的选择，样品可以在室温下保存几个月，并且便于邮寄。但是也会有一定程度上的敏感度下降。另一种选择是从采集死鸡的器官，但是储存和运输都会面临很多问题。
可以选择把样品分开或者合并。分开的样品用于检测一群鸡中的疫苗覆盖情况。合并样品能节约成本，用于对鸡群整体做出定性的判断，通常用于评估鸡群中是否存在野毒或疫苗毒。一般10个棉拭子样品可以代表整个鸡群的状况。健康鸡和出现症状的鸡都应该被采到。
为了更好的解读结果，应该为实验室提供尽可能详细的样品信息，例如采样日龄，症状，免疫程序和农场位置等。
PCR 分析: 结果的价值与样品的质量和种类选择有关。
总结
在决定使用分子生物学方法检测分析时应该考虑：采用哪种诊断方法（包括样品的种类和数量和分析方法），动物的日龄，表现出的临床症状（现在和过去），免疫的疫苗和该区流行病毒的基因型。常规RT-PCR和实时RT-PCR，对基因的通用检测和特定检测应该结合起来使用，以获得尽可能广的覆盖面。谨记当采用不同的检测方法时，可能会得出看起来完全相反的结果。
来源：兽药药理与处方技术
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