科研动态 | 禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立
摘要：为了简便、快速、准确的检测禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5、H7、H9亚型（lumpy skin disease virus，LSDV），本研究通过对禽流感病毒HA2基因保守区域的分析，设计、合成特异性引物和探针，结合Taq man-MGB探针技术，建立禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法。该方法敏感性较高，最低检出限为11copies/μL；与禽类常见病毒核酸均无交叉反应；不同稀释度的重组质粒的检测变异系数为0.1%～1.16%。上述结果表明，本研究建立的禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法比传统病毒分离鉴定方法时间更短，具有敏感性强、特异性高的特点，更适用于禽流感病毒H5、H7、H9亚型快速诊断及流行病学调查。关键词：禽流感病毒；H5亚型；H7亚型；H9亚型；多重荧光RT-PCR
禽流感（avian influenza，AI）是由正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病。禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。尤其是高致病性禽流感，是OIE规定的法定报告A类动物疫病。禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒。
目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。以分子生物学技术为基础的荧光PCR方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。本研究基于TaqMan-MGB荧光RT-PCR技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。
1 材料与方法
1.1 质粒样品
携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL。
1.2 禽流感病毒核酸样品
禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。
1.3 特异性核酸样品
鸡传染性支气管炎（LDT3-A株）cDNA全基因组、鸡传染性喉气管炎（LDT3-A株）cDNA全基因组、鸡新城疫病毒（La Sota株cDNA全基因组）、传染性法氏囊病毒（B87株）cDNA全基因组、减蛋综合征（AV127株）DNA全基因组、健康鸡组织全基因组DNA；由扬州大学制备、保存和提供。
1.4 试验试剂
酶反应体系：5×Neoscript RT Premix-UNG（Probe qRT-PCR）（Cat：M5134-ZD1），购自珠海宝锐生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
ABI 7500实时荧光定量PCR仪系统，美国应用生物系统公司。
1.4 引物、探针的设计
本研究通过检索GenBank上收录的禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型传统毒株和变异毒株的HA2基因序列，利用DNASTAR软件分析比较各亚型序列中高度保守又具有特异性的区域，应用Oligo软件设计多对特异性的引物、TaqMan探针，由通用生物系统（安徽）有限公司合成。
1.5 禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立
通过单重荧光RT-PCR方法对设计的引物探针进行筛选，筛选出可准确扩增相应亚型靶标且不能扩增其他亚型的引探组合，再将单重扩增筛选的引探相互配对，筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9三个亚型且对Ct值和扩增效率影响不大的三组引探，采用矩阵法摸索引探浓度，优化反应条件，建立三重实时荧光RT-PCR方法。
1.6 敏感性试验
用无核酸酶水10倍梯度稀释重组质粒pUC57-AIV-H579（10?copies/μL），稀释为10?copies/μL、10?copies/μL、10copies/μL、1copies/μL，采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法进行检测，用于进行最低检测限研究。每个样品重复检测3次，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限；根据试验结果，在估计检测限的浓度附近制备若干梯度浓度样品，每个浓度重复检测20次，将具有95%以上阳性检出率的最低浓度水平作为本检测方法的最低检测限，用Graphpad Prism软件进行概率Logistic模型回归分析。同时对不同梯度浓度的重组质粒的Ct值与浓度的对数进行线性回归分析，计算相关系数（R?）。
1.7 特异性试验
采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法对鸡传染性支气管炎（LDT3-A株）cDNA全基因组、鸡传染性喉气管炎（LDT3-A株）cDNA全基因组、鸡新城疫病毒（La Sota株cDNA全基因组）、传染性法氏囊病毒（B87株）cDNA全基因组、减蛋综合征（AV127株）DNA全基因组、健康鸡组织全基因组DNA进行检测，同时设置阳性重组质粒pUC57-AIV-H579做阳性对照，研究该检测方法的特异性。
2 结果
2.1 禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立
本研究通过单重和多重荧光RT-PCR试验对设计的引物、探针进行筛选，优化反应条件。最终确定的禽流感病毒H5亚型引物工作浓度为300nM，探针工作浓度为150nM；H7亚型引物工作浓度为400nM，探针工作浓度为200nM；H9亚型引物工作浓度为300nM，探针工作浓度为150nM；模板添加量为5μL，反应程序为：50℃/20min；95℃/3min；95℃/10s，54℃/30s，40个循环，采集荧光信号，荧光通道FAM（H5）/VIC（H7）/ROX（H9）。
确定筛选出最终确定的引探序列如下：
H5-F：5'-TACCARATAYTGTCAATTTATT-3'；
H5-R：5'-GARCACATCCATAAAGATAG-3'；
H5-LP：5'-CTYGCCACTGTTG-3'；
所述探针序列5'端标记的荧光基团为FAM，探针序列3'端标记的淬灭基团为MGB。
H7-F1：5'-AGGCAATGCAAAATAGAATA-3'；
H7-R1：5'-GGCNAGAAGTATGAAACATGAT-3'；
H7-LP1：5'-AAGTATCACATCTT-3'；
所述探针序列5'端标记的荧光基团为VIC，探针序列3'端标记的淬灭基团为MGB。
H9-F2：5'-ATTTATTCKACTGTCGC-3'；
H9-R2：5'-CTGCANGAYCCATTNGACAT-3'；
H9-P2：5'-AAGGCAGCAAACCC-3'；
所述探针序列5'端标记的荧光基团为ROX，探针序列3'端标记的淬灭基团为MGB。
2.2 分析敏感性试验
采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法对10倍梯度稀释的重组质粒pUC57-AIV-H579（10?copies/μL、10?copies/μL、10?copies/μL、10copies/μL、1copies/μL）进行检测，每个样品重复3次，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限，结果显示，10?copies/μL、10?copies/μL、10?copies/μL、10copies/μL的检出率为100%，1copies/μL未检出，因此以10copies/μL作为估计检测限（表1，图1）。
以重组质粒不同浓度拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，获得线性回归方程。结果显示禽流感病毒H5亚型靶标的线性回归方程为y=-3.302x+36.504，R?=0.99；禽流感病毒H7亚型靶标的线性回归方程为y=-3.262x+36.517，R?=0.99；禽流感病毒H9亚型靶标的线性回归方程为y=-3.389x+36.44，R?=0.991，梯度稀释的重组质粒与Ct值线性关系良好（图2）。
在估计检测限10copies/μL的浓度附近制备15copies/μL、5copies/μL、1copies/μL梯度浓度样品，每个浓度重复检测20次，结果显示15copies/μL、10copies/μL的浓度样品的检出率分别为100%、100%；5copies/μL的检出率约为75%，1copies/μL的检出率不足10%，因此将10copies/μL的浓度样品确定为最低检测限（表2）。概率回归分析，在95%的置信区间内3个靶标的分析敏感性为11copies/μL。（图3）。
2.3 特异性试验
采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法对鸡传染性支气管炎（LDT3-A株）cDNA全基因组、鸡传染性喉气管炎（LDT3-A株）cDNA全基因组、鸡新城疫病毒（La Sota株cDNA全基因组）、传染性法氏囊病毒（B87株）cDNA全基因组、减蛋综合征（AV127株）DNA全基因组、健康鸡组织全基因组DNA进行检测，结果显示均为阴性，而重组质粒pUC57-AIV-H579的检测结果为阳性，说明该检测方法的特异性较好，不与其他病毒核酸产生交叉反应（图4）。
3 讨论
在对禽流感的监测和控制环节中，最重要的是要进行快速的诊断，及时划定疫点、疫区，并采取封锁等控制措施，防止疫情的扩散。因此，禽流感疫情现场快速诊断，对于采取果断有效的扑灭和防控措施十分关键。传统的病毒分离测序法费时、费力；用于分型鉴定单重荧光RT-PCR每次仅能检测一个亚型，不能做出快速而及时的诊断。因此，建立一种快速、准确的分型鉴别方法对禽流感的防控具有重要意义。
本研究克服现有技术的不足，利用Taq man-MGB荧光RT-PCR技术建立可有效区分禽流感病毒H5、H7、H9亚型的多重荧光RT-PCR检测方法。该方法敏感性较高，最低检出限可达11copies/μL，重复性良好，与禽类常见病毒核酸之间无交叉反应，且反应快速、操作简单，适合大批量检测，对于禽流感病毒的监控、鉴定具有一定的应用价值。
AIV基因组有8个独立片段，各自编码功能性蛋白，尤其是HA基因及其编码蛋白尤为重要，与病毒抗原性、毒力、致病性及感染宿主密切相关，同时该基因也是变异较大的基因，是国内外学者研究较多的基因。秦智峰等基于HA基因建立的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法，灵敏度可达到500copies；屈素洁等基于HA基因建立的禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法，检测病毒RNA的灵敏度可达到10-4copies/μL；Monne等基于HA基因建立禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法，检测灵敏度可达50copies/μL。禽流感病毒亚型众多、易变异，对于新的变异株传统的试剂容易漏检。针对这一难点，本研究比对禽流感病毒传统毒株和变异毒株的HA2基因的保守区域，引探设计中使用简并碱基，靶点覆盖范围广，包含近年新出现的突变株。其中H5亚型参考毒株序列，包含近年来出现的clade 2.2，clade 7.2，clade 2.3.2.1，clade 2.3.4，clade 2.3.4.4，clade 2.3.2.1a，clade 2.3.2.1c，clade 2.3.4.4d，clade 2.3.2.1d等分支及亚分支；H7亚型参考毒株序列包含HPAI和LPAI H7N9基因序列；H9亚型参考毒株序列包含国内3大分支：A/Chicken/Beijing/1/94（BJ94）或A/Duck/HongKong/Y280/97（Y280）、A/Quail/HongKong/G1/97（G1）、A/Duck/Hong Kong/Y439/97（Y439）以及近几年在中国鸡群中流行病毒株A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）等。
本研究建立的禽流感病毒H5、H7、H9亚型的多重荧光RT-PCR检测方法能够有效鉴别H5、H7、H9亚型，具有敏感性强、特异性高、检测时间短等特点，从而为更好地预防和控制禽流感发生和流行提供重要的技术手段。
参考文献：略
作者：杨楠/郑州中道生物技术有限公司；翟少伦/广东省农业科学院动物卫生研究所
来源：《中国动物保健》2021年6月刊
页:
[1]