陈化兰院士团队：中国禽流感病毒变异新发现
作者 | 华中农大WN4月27日，中国哈尔滨兽医研究所陈化兰-施建忠团队（通讯）与日本中部大学（Chubu University）合作开展了H7N9禽流感疫苗免疫后中国的H7N9禽流感病毒的变异研究发现：
1.病毒已形成两种不同的基因型；
2. 对鸡具有极高的致死性，在鸭子中引起轻度感染，但在小鼠中表现出不同的致病性；
3. 病毒以高亲和力与禽类受体结合，但逐渐失去了与人源受体结合的能力。
同时，研究人员发现：2019年分离出的H7N9 禽流感病毒与用于家禽H7N9流感控制的疫苗株在抗原学上有所不同，因此无法在疫苗接种的鸡中完全防止此种H7N9禽流感病毒的复制。
总体来说，禽流感病毒已经发生了诸多变异，病毒从疫苗诱导的免疫中逃逸的能力增强，加强了对禽类的感染，但对人类的感染能力反而下降了。相关研究发表在病毒学TOP期刊Plos Pathogens。
原文解析：
H7N9病毒的分离及遗传学分析
科研人员从送检的样本中整理发现，病毒阳性样本来自中国南部的两个省（安徽和福建）和中国北部的六个省（陕西，山西，内蒙古，宁夏，河北和辽宁）。从蛋鸡中分离出十二种病毒，从肉鸡中分离出五种病毒，从鸭子中分离出一种病毒，从动物园的孔雀中分离出一种病毒。
为了研究它们的遗传关系，对19个H7N9流感病毒的全基因组进行了全序列测定。所有19株AIV在其HA裂解位点均具有一个类似的氨基酸基序-PKRKRTAR / G-，符合高致病性AIV的标准，先前的研究表明，HA中的186V和226L氨基酸（始终使用H3编号）对于H7N9病毒与人型受体的结合非常重要。2013年至2017年分离的H7N9低致病性AIV中，分别有94.2％和97.6％的HA基因分别具有186V和226L。我们的序列分析表明，本研究中的所有19株HPAIV的HA均具有186V但也具有226Q。
H7N9高致病性禽流感病毒的毒力
为了了解最近H7N9高致病性禽流感病毒的毒力，我们检测了14株从不同时间、不同地点和不同鸟类中分离的H7N9代表性毒株。8只小鼠经鼻接种106 EID50的试验病毒；在所有测试的三只小鼠肺中，所有14种病毒均已复制。在一只小鼠的大脑中还检测到四种病毒，在一只小鼠的脾脏中检测到一种病毒，但在任何小鼠的肾脏中均未检测到病毒。其中10种病毒在两周观察期内没有致命性。这些结果表明，分离到的H7N9高致病性禽流感病毒对小鼠具有明显的毒力，但大多数对小鼠无致死性。
为了研究它们在家禽中的复制和毒力，科研人员在鸡和鸭中检测了从不同宿主分离的三种代表性病毒（CK/LN/SD009/18、DK/FJ/SE0377/18和PCK/LN/SD004/19）。对11只6周龄SPF雏鸡进行了106 EID50的静脉注射并于第3天从所有禽类中收集咽拭子和泄殖腔拭子。在咽拭子和泄殖腔拭子中均检测到H7N9病毒，并在鸡中全身复制，在所有测试器官中均检测到高滴度。每组剩余8只鸡在接种后5天内死亡。
以8只3周龄SPF鸭为实验组，接种106株EID50病毒。8只鸭中有1只咽拭子中检测到CK/LN/SD009/18病毒，泄殖腔拭子和任何器官中均未检测到CK/LN/SD009/18病毒；五只鸭子都在感染中存活下来，没有一只发生血清转化。这些结果表明，H7N9病毒对鸡的致死率很高，但对鸭的感染率很低。
H7N9病毒的受体结合特性与变异
以前的研究表明，H7N9低致病性病毒以高亲和力结合人型受体，其HA中的两种氨基酸（186V和226L）促成了这一特性。氨基酸186V在所有H7N9高致病性禽流感病毒中都是保守的；然而，HA中的226L仅在少数早期H7N9高致病性禽流感病毒中检测到。而这项研究中分离的所有19种H7N9病毒的HA中都含有226Q。为了研究H7N9高致病性禽流感病毒的受体结合特性，我们选择了五个毒株（三个来自2018年，两个来自2019年），并测试了它们对两种不同糖聚合物的亲和力。结果表明，H7N9 高致病性禽流感具有不同的受体结合特性，2019年最新分离出的病毒减弱了与人型受体的结合能力。
流感病毒在自然界中传播时容易发生抗原变异。为了研究H7N9高致病性禽流感病毒的抗原性，科研人员制备了针对H7-Re2疫苗株和本研究分离的两株H7N9株（CK/LN/SD014/18和CK/IM/SD010/19）的鸡抗血清。结果发现，2018年分离的11种病毒与H7-Re2抗血清交叉反应良好，其HI抗体滴度比同源病毒H7-Re2和CK/GX/SD098/17低2-4倍；其他8种病毒，包括2018年12月分离的1种病毒和2019年分离的7种病毒，与H7-Re2抗血清反应不良，其HI抗体滴度比同源病毒H7-Re2和CK/GX/SD098/17低8-32倍。这些结果表明，2019年分离出的H7N9病毒与H7-Re2疫苗株在抗原学上有所不同。
H5/H7三价灭活疫苗对不同H7N9病毒的保护效果
自2018年12月以来，使用两种H5种子病毒（Re-11和Re-12Re12）和1种H5/H7三价灭活疫苗已用于家禽。H5/H7三价灭活疫苗是否能完全预防抗原变异的H7N9病毒？以10只3周龄雌性SPF鸡为试验组，肌肉注射0.3 ml疫苗或等量PBS作为对照。用H7N9高致病性禽流感病毒攻击后，所有对照鸡都通过咽和泄殖腔排出病毒，并在攻击后5天内死亡。用CK/GX/SD098/17或CK/SX/SD006/18攻击的免疫鸡在任何时间点均未检测到病毒脱落。然而，用PCK/LN/SD004/19攻击的10只免疫鸡中的2只和用CK/IM/SD010/19或CK/LN/SD25/19攻击的10只免疫鸡中的5只都会释放病毒。所有接种疫苗的鸡都明显健康，并在攻击后的两周观察期内存活。这些结果表明，H5/H7-Re2三价疫苗具有免疫原性，对鸡H7N9病毒（I组）具有充分的保护作用，但不能完全阻止抗原变异组H7N9病毒（II组）的复制。
为了研究H7N9病毒抗原差异的分子基础，我们比较了HA基因并鉴定了HA蛋白中的8个氨基酸，这些氨基酸在抗原组I的大多数病毒中是保守的，但在抗原组II的病毒中是突变的。这8个氨基酸中，除第88位氨基酸外，其余7个位于HA1蛋白球状头部区域的表面。进一步，一个突变体（PR8-IM19/HA-135V160A）在HA的135和160位都含有氨基酸变化，并且发现其对H7-Re2抗血清的反应性进一步增强（高16倍）。表明，HA中的135T和160T突变对于抗原II组病毒的抗原变异或漂移是重要的。
总结：
众所周知，H7N9禽流感病毒在中国已经引起了五次人类流感大流行。自2017年9月以来，通过在家禽中使用H7N9疫苗，人类病例得到了成功预防。然而，H7N9禽流感病毒尚未在中国从家禽中消灭，其进化方向也未得到充分的研究。本研究证实HA蛋白中第135位和第160位的两个氨基酸突变增加了两个糖基化位点，并促进了H7N9病毒从疫苗诱导的免疫中逃逸，为H7N9病毒的进化和控制提供了重要的信息。
参考文献：https://doi.org/ 10.1371/journal.ppat.1009561。
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