部分地区禽戊型肝炎病毒分子流行病学分析
禽戊型肝炎病毒(avain hepatitis E virus,a HEV)属于肝炎病毒科正戊肝病毒属 B 种,是一种无囊膜的单股正链 RNA 病毒,主要流行4 个基因型:澳大利亚和韩国的基因 1 型,美国的基因 2 型,中国和欧洲的基因 3 型,匈牙利和中国台湾的基因 4 型。该病原引起的疾病最早可追溯到 20 世纪 80 年代澳大利亚、美国、加拿大等陆续报道的鸡大肝大脾病(big liver and spleen disease,BLS)或肝炎脾大综合征(hepatitis-splenomegaly,HS),2001年确定病原并命名为禽戊型肝炎。
1994 年我国就有 BLS 抗体阳性的报告,2010 年和 2014 年分别从肉种鸡和蛋鸡群中分离到a HEV。a HEV 多感染产蛋期鸡群,病程为 1~2 个月甚至更长,临床主要表现为死淘率升高(5%~15%)。
剖检可见,肝脾肿大、出血,卵泡萎缩变形等,后期易继发细菌感染。为分析我国 a HEV 基因变异情况,对 2018 年从山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地疑似感染 a HEV鸡群中采集的肝脏、脾脏病料样品进行 a HEV RT-PCR 检测,并对 a HEV阳性产物进行 ORF1 基因序列测定与遗传进化分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
2018 年采集山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏 9 个省份疑似a HEV 感染的鸡肝脏、脾脏样品共计 679 份,无菌处理后,置于 -20 ℃保存备用。
1.1.2 试剂
RNAout 提取试剂盒,购自天恩泽生物公司;Hi Script?II One Step RT-PCR Kit,购自诺唯赞生物公司;DL 2 000 DNA Marker,购于宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 参照 Gen Bank 已公布的 a HEV-ORF1 基因核苷酸序列,利用 Oligo 6.0 软件设计扩增 a HEV-ORF1 基因的特异性引物(a HEV-ORF1-F:5'-FCGTCTCGCAGATAGCAGAGTCC-3';a HEV-
ORF1-R:5'-TATAGCCCATTCCCGCTCAATC-3')。
引物由北京华大基因科技有限公司合成,预期扩增目的片段为750bp。
1.2.2 病毒核酸提取 组织 RNA 和 DNA 提取,按核酸提取试剂盒和核酸提取仪说明书进行操作。
1.2.3 核酸扩增 用 RT-PCR 一步法试剂盒扩增c DNA:45 ℃反转录 30 min;94 ℃预变性 3 min,94 ℃变性 40 s,53 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 1 min,共 30 个循环;72 ℃再延伸 10 min,4 ℃保存10 min。
PCR 产物用 1.0% 琼脂糖凝胶进行电泳,置于凝胶成像系统中观察结果。
1.2.4 ORF1 基因序列分析 挑取阳性样品产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。用 Meg Align 和 Mega6.0 软件,对测定的 a HEV-ORF1 基因序列与 Gen Bank 中部分代表性毒株序列进行同源性比较和遗传进化分析。
2 结果
2.1 RT-PCR 检测
对送检的 679 份样品处理后进行 RT-PCR 检测,其中 37 份样品扩增出 750 bp 左右的目的片段(图 1),为 a HEV 阳性。将测序结果与 Gen Bank比对,结果均为 a HEV。
2.2 ORF1 基因同源性分析 从不同地区 RT-PCR 阳性样品中,随机选取15 个试验毒株 ORF1 核苷酸序列,利用 Meg Align进行同源性比较。结果(图 2)显示:试验株之间ORF1 基因同源性为90.1%~100%,而与基因 1 型的澳大利亚株和韩国株同源性为 85.5%~89.0%,与基因 2 型的美国原型株和美国无毒株同源性为85.5%~88.2%,与基因 3 型的欧洲株和中国株同源性为 86.3%~89.7%,与基因 4 型的匈牙利株和中国台湾株同源性为 86.4%~88.5%。
2.3 ORF1 基因遗传进化分析
利用 Mega6.0 对 15 株试验株的 ORF1 基因进行序列比较,绘制遗传进化树。结果(图 3)显示:15 株 a HEV 均属于戊型肝炎 B 种,形成独立的基因分支,但不属于已报道的 4 个基因型(基因 1~4 型)。
3 讨论
目前国内外都对 a HEV 进行了血清学和分子流行病学调查研究。我国南方鸡群 a HEV 血清阳性率约为 33%,广东、山东、黑龙江 3 个省份的鸡群血清阳性率约为 28.3%。这些血清学调查结果均显示,a HEV 已在我国鸡群中广泛流行。但血清学调查只能反映鸡群的抗体水平,无法检测鸡群的病原感染情况,且病毒分离难度较大;而分子生物学方法操作简单、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好,已被广泛应用于临床检测。
ORF1 基因编码 a HEV 的多聚蛋白,包含甲基转移化酶、解螺旋酶以及 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。它们是目前国内外 a HEV 的主要分型依据。
本研究通过 RT-PCR 方法,对 2018 年山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地区疑似 a HEV 感染鸡群的679 份肝脏和脾脏病料样品进行 a HEV 检测,结果检出 37 份阳性样品,阳性检出率为 5.45%,说明我国鸡群存在不同程度的a HEV感染,这应引起养鸡企业的高度重视。
通过对 15 株 a HEV 野毒株的 ORF1 基因进行测序分析,发现所检出毒株均属于 B 种,但不属于现已报道的 4 个基因型,为新亚型。通过核苷M. DL 2 000 DNA Marker ;酸同源性比对分析发现,15 株 a HEV 野毒株与基因 1~4 型的代表株同源性均低于 90%,而 15 株分离株之间的差异不大,同源性为 90.1~100%。目前关于 a HEV 新亚型的相关报道较少,本研究为我国a HEV 的分子流行病学分析提供了补充和参考。
来源:鸡保姆整理,作者:张 翔,林婷婷,刘丰波,宋姗姗,李 彬,栾栋祖,王群,刘 平,刘红祥,马 冬,任衍倍,刘 东。
百分之五点多,意思是大部分肝病都不是戊型肝炎啊
谢谢分享,按概率推算,戊型肝炎的发病率不是很高,但临床却很常见 牧鱼郎 发表于 2021-03-15 10:12
百分之五点多,意思是大部分肝病都不是戊型肝炎啊
https://app.jbzyw.com/public/emotion/face_068.pnghttps://app.jbzyw.com/public/emotion/face_068.png 实验室的很多结果都和兽医在临床上的判断不符,但是基层兽医且在治疗的方法上不断探索和突破。
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