默沙东动物保健特约技术讲座: 鸡传染性支气管炎的免疫防控技术
默沙东动物保健特约技术讲座—— — 家禽免疫学知识摘要：
鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV 是鸡的重要呼吸道病原体，不断出现新的血清型和变异株，每年在全球造成家禽养殖业的经济损失，给家禽养殖业带来巨大的困扰。目前针对鸡传染性支气管炎最主要的防控技术是疫苗接种，本文旨在概述国内外学者对 IBV 及疫苗的研究进展、不同疫苗的效果及其优缺点，为今后科研工作者研发新型鸡传染性支气管炎疫苗提供新思路。
关键词：鸡传染性支气管炎 变异株 疫苗
1 鸡传染性支气管炎
1.1 鸡传染性支气管炎病毒
鸡传染性支气管炎病毒（IBV）属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒基因组为长 27kb 的单股正链 RNA，编码多种蛋白，最主要有几种结构蛋白：纤突蛋白（S 蛋白），包膜蛋白（E 蛋白）和病毒粒子形成所涉及的膜蛋白（M 蛋白），以及一种参与基因组包装的蛋白质核衣壳（N 蛋白），另外还编码一些非结构蛋白。S 蛋白是高度糖基化的跨膜蛋白，含有 1160 个氨基酸，大小为 150～200 kDa。一个跨膜结构域和一个短的 C 末端尾巴组成 S 蛋白裂解的信号序列。S 蛋白在宿主细胞中转录翻译后被切割成含氨基末端的 S1 蛋白和含羧基末端的 S2 蛋白。S1 蛋白通常发挥受体结合的作用，是负责中和抗体的表位、决定 IBV 血清特异性抗原决定簇的主要蛋白；S2 蛋白则有助于病毒的融合，在多数 IBV 毒株中比较保守，但可以诱发较弱的中和抗体产生 。
M 蛋白是一种略微突出到表面的跨膜蛋白，含有 220～262 个氨基酸，N 末端区域被糖基化，是 IBV 中含量最多的糖蛋白。M 蛋白能够控制并介导 IBV 从粗面内质网或者高尔基体膜出芽，在 IBV 装配时与 N 蛋白互相作用，使 N 蛋白结合到囊膜上，M 蛋白糖基化的作用及其免疫学功能尚不清楚还需要进一步的研究。N 蛋白是 IBV 的病毒内部结构蛋白，N 蛋白和 M 蛋白直接相互作用，S-M 蛋白片段相互作用的研究结果表明 N 蛋白和 S 蛋白之间存在间接相互作用。N 蛋白与基因组 gRNA 结合形成螺旋核糖核蛋白复合物（RNPC），在复制过程中协助病毒基因组的转录、复制、翻译和包装过程。包膜蛋白（E 蛋白）包含高度疏水的跨膜 N端和胞质 C 端结构域，该蛋白可能与病毒包膜形成、组装、出芽、离子通道活性和细胞凋亡有关。尽管 E，M 和 N 蛋白对于 IBV 的复制至关重要，由于 S 蛋白在宿主细胞结合和中和表位中的作用，S 蛋白是目前被研究较多的蛋白质，也被认为是较重要的蛋白。
1.2 鸡传染性支气管炎病毒
分型及变种IBV 是高度传染性的商业家禽病原体，容易感染上吸道，也能感染肾脏、生殖道和肠道，并且会导致感染蛋鸡的产蛋量下降，因此鸡传染性支气管炎按照临床表现可分为呼吸型、肾型、肠型和生殖型，还有一些其他特征的中间型。
IBV 不仅有不同的临床分型，同时在全球范围内分布存在多种不同形式的血清型。通常IBV 可以通过基于核酸或基于抗体的方法进行分类，分别提供基因分型结果和血清分型结果。血清型是 IBV S 蛋白上的表位暴露后由特异性循环抗体定义，交叉中和试验是区分病毒血清型的常规方法，可分析无特定病原体（SPF）鸡中制备的抗血清的中和活性；血凝抑制试验也用于 IBV 血清分型，但要用胰酶或磷脂酶 C 处理病毒才能产生血凝活性。
病毒的遗传突变和重组通常会导致不同的IBV 基因型、血清型和病理型。负责诱导中和抗体的表位与纤突蛋白基因的 S1 部分中的 3 个高突变序列区（HVR）紧密相关，HVR 的序列通常与血清型相关，其中具有＞95％序列相似性的病毒通常认定为同一类型，而具有＜85％相似性的病毒认定为单独的血清型。根据现代进化假说，遗传多样性和选择过程是进化的两个基本步骤。病毒复制过程中的自发错误（核苷酸取代，缺失或插入以及重组） 为选择提供了材料，最终导致病毒进化。由于重组的自然复制，IBV 中的分子进化过程被认为是造成该病毒许多不同血清型的重要原因。新的 IBV 血清型的出现是通过选择作用于这些分子而发生变化，选择压力可能有许多不同的来源，可能是几种类型的疫苗，受感染宿主的微环境，或物理和生物安全条件 。
接种疫苗是控制 IBV 感染的最经济、最有效的方法。但是这个方法已受到多种因素的挑战，新的 IBV 血清型的出现（目前有 50 多种）几乎没有交叉保护，重要的是一些可能获得疫苗的 IBV 株随着新变异体的出现而消失，因此必须开发新疫苗。大多数 IBV 疫苗是源自经典或变异血清型的减毒或灭活的疫苗。麻省血清型IBV 疫苗在世界范围内得到广泛使用，它是第一批生产的疫苗，也是多年来唯一可用的疫苗。
在许多家禽生产国家，麻省血清型 IBV 是唯一获得许可的 IBV 疫苗血清型 。随着新型血清型和变异体的出现，疫苗不断地生产出来以对抗区域或局部性的血清型，例如美国的 Ark、Conn、Del、GA98、GA08 和 GA13，以及欧洲、亚洲和南美的 793/B、QX 和 Q1 。但研究表明针对这些毒株的疫苗通常导致不良的免疫反应，尤其是针对局部毒株。减毒的活 IB 疫苗也被证明会加快新的致病性 IBV 变异株的出现。
在最初出现于中国并传播到亚洲、欧洲，给家禽养殖者造成巨大经济损失的类似 QX 的毒株中，观察到了地理分布和组织倾向性的变化，已引起研究人员的注意。尽管尚未完全了解病毒进化和新血清型出现的确切机制，全世界存在数十种个体血清型以及这些类型的数百种变体，让我们明确了解到关注 IBV 的分子进化较为重要。
2 IB 疫苗
2.1 减毒活疫苗
减毒 IB 活疫苗是用于控制 IBV 感染的第一代 IBV 疫苗，也是家禽业最常用的疫苗种类。减毒 IB 活疫苗是从病原体中分离出来的，方法是将它们连续传代到无特定病原体（SPF）的胚胎卵中。这些疫苗已有市售，可在家禽出孵第一天或第一周内通过饮水或喷雾施用。由于减毒活疫苗接种后的免疫时间较短，因此应在初次接种疫苗后 2～3 周，用相同或其他毒株的组合进行加强免疫接种。即使在世界各地使用了一些具有区域或局部影响的毒株，但大多数市场销售的减毒活疫苗均来源于强毒株，例如基于 Massachusetts 血清型的 H 52 和 H 120 株。
活疫苗通常用于肉鸡中，并用作育种的加强剂。但各国之间在批准使用的 IBV 疫苗株类型上可能存在差异，这应以当地或区域流行毒株的流行病学情况为指导。考虑到物流和经济方面的因素，一些市售的减毒 IB 疫苗已与其他病毒疫苗联合使用，例如针对新城疫病毒，马立克氏病病毒和传染性法氏囊病病毒的疫苗，但是尚不清楚该组合是否会影响对组合抗原的免疫反应。减毒活疫苗的某些局限性包括毒力，组织损伤和 MDA 干扰等方面。活疫苗造成的组织损伤可能导致病理疾病或继发性细菌感染，尤其是在低日龄雏鸡中较为明显。
有研究表明，尽管通过传代分别生产 H 52 和 H 120 IB 疫苗来降低病毒毒力，但这些疫苗仍有可能潜在地引起了气管的严重病理现象，并可能导致疫情暴发。IB减毒活疫苗的另一个局限性是疫苗株和强毒株之间的潜在重组，会导致出现新的 IBV 血清型。在一项研究中，证明了用减毒活 H 120 疫苗接种可促进病毒在肉鸡之间的传播，从而潜在地支持病毒的传播和持久性 。为了减少此类问题，研究人员一直致力于探索使用反向遗传操作技术，在宿主中创建可能具有无致病性但能够复制并诱导免疫反应的疫苗病毒的选择。
2.2 灭活疫苗
灭活疫苗通常是通过甲醛等灭活剂灭活后制成，IBV 灭活疫苗可以单独使用或与减毒 IB活疫苗结合使用，正如《禽病学》第十二版中提到的灭活疫苗的使用必须在两次以上活疫苗的基础上使用才有意义。这些疫苗通常在 13～18周龄时给蛋鸡和种鸡通过注射接种。虽然灭活疫苗不能复制，不会引起临床症状并引起病理影响，但灭活疫苗也有局限性。与减毒活疫苗相比，灭活疫苗仅诱导以抗体为特征的较短的免疫反应而非 T 细胞介导的免疫反应，因此在大多数情况下，传染性支气管炎更多的是依靠黏膜免疫，灭活疫苗则需要结合减毒活疫苗，使用大剂量佐剂或多次接种。这可能会增加与疫苗开发和销售相关的成本，从而限制了其应用。作为注射剂，在大型家禽饲养场所施用灭活疫苗既困难又不切实际，注射部位免疫反应的问题也可能导致机体排斥作用。
2.3 新型疫苗
2.3.1 病毒载体疫苗
通过研究使用病毒载体递送目的基因的能力，病毒载体疫苗能够在不引起病理学的情况下进行复制和表达，基于载体的疫苗中包装和表达不同的免疫原性蛋白质亚基，通过对各种分裂和非分裂细胞的嗜性可以持续释放抗原。研究人员已经开发了针对 IBV 的试验性重组载体疫苗。这些疫苗被证明可诱导免疫反应，显著增强并预防 IB 疾病。尽管病毒载体疫苗的研究进展有望解决于提供有效的免疫应答并减少IBV 减毒活疫苗中所见的 RNA 突变方面问题，但该技术仍然存在局限性，包括现有的免疫问题或干扰该活载体的母源性免疫问题，减少了抗原呈递细胞对抗原的吸收，从而减少了转基因表达以及特异性免疫反应；宿主系统中缺乏适当的蛋白质折叠和糖基化作用，以及翻译后修饰可能会改变构象和表位排列，从而影响其免疫原性和功效。这些因素目前在重组 IB 疫苗的设计和选择中受到特别关注。有研究表明，使用含有 IBV-S1 糖蛋白的重组腺病毒疫苗可引起显著的抗体应答，在用B 型血清型或 C 型血清型 IBV 毒株进行同源和异源攻毒后，可对气管损伤提供 90%100％的保护 。用腺病毒载体对小鼠进行口服免疫显示可以避免现有或母源抗体对载体的中和，并且腺病毒载体疫苗有望用于家禽口服疫苗。口服免疫在家禽免疫中具有多个优势，例如易于应用和能够减轻与注射操作相关的压力。基于载体的口服疫苗可能会获得足够的转基因特异性抗体应答，仍需要进一步改进以实现最佳的 T细胞应答，例如剂量增加，纳米颗粒包被，双重载体的使用。虽然基于慢病毒的 IB 疫苗并不常见，但慢病毒载体正在进入兽医疫苗的视野。总之，只有同时进行的比较研究才能帮助理解一种媒介相对于其他媒介的优势 。
2.3.2 亚单位和合成肽疫苗
该技术需要使用病毒的一部分来诱导特异性免疫反应。亚单位疫苗衍生自病原体蛋白或多糖，而合成肽疫苗则是由病原体肽或编码免疫原性表位的一部分基因组制成的。在开发的实验阶段，亚单位和合成肽疫苗显示出对 IB的控制较有前景，一些研究人员已致力于开发可针对多种 IB 血清型使用的多表位多肽疫苗。Yang 等基于来自 S1 蛋白和 N 蛋白基因的多个表位开发了 IB 疫苗。S1- 和 N- 基因内的表位分别被靶向诱导中和抗体以及 CTL 应答。使用设计的合成肽疫苗进行的表达分析和免疫研究产生了显着的体液反应和细胞介导的免疫反应，能够在病毒攻击后产生 >80％的保护 。
2.3.3 质粒 DNA 疫苗
与涉及活载体的基于重组载体的疫苗不同，DNA 疫苗使用的质粒包含编码有免疫原性蛋白质的基因，这项技术已经引起了广泛的关注，并且一些产品已经处于不同的开发或试验阶段。根据 Ark IBV 血清型的 S1 基因，开发了一种名为 pDKArkS1-DP 的 DNA 疫苗，通过卵内途径接种疫苗，然后每隔 2 周用减毒活疫苗进行免疫，产生了显著的免疫应答，达到 100%的疾病预防比例。除了卵内 DNA 疫苗接种外，还评估了其他新方法，例如肌肉注射由 S1，S2和 N 区域设计的脂质体包裹的多表位 DNA 疫苗会引起 CD + 4 ，CD + 3 和 CD + 8 ，CD + 3 细胞数量增加，基于表位疫苗的一些优势包括能够将多种免疫原包装在小型输送系统中以进行靶向抗体和 CTL 反应，并在 80％的接种者中产生保护性免疫应答。
由于大多数 DNA 疫苗是通过注射给药的，DNA 疫苗具有包括免疫途径在内的一些局限性，因此难以在大型商业性家禽养殖场中应用。但可以在孵化场进行卵内 DNA 疫苗接种，通过在饮用水中或作为喷雾疫苗给予疫苗或者通过纳米粒子介导的 DNA 传递将有助于保护疫苗免于酶促降解，并增强其在黏膜表面对黏膜反应的可用性来解决以上的问题。DNA 疫苗可以在母源抗体存在的情况下使用，能够诱导抗体和 T 细胞免疫反应，具有安全性、热稳定性，表达多种蛋白质的能力。DNA 疫苗生产成本低，可以在较短的时间内生产出来，从而能够应对新出现的病毒威胁 。
2.3.4 反向遗传疫苗
反向遗传疫苗是通过反向遗传技术产生的重组 IBV，在实验室设计的遗传学系统适合家禽业的需求。IBV 疫苗毒在实验室中克隆，可以由研究人员通过同源重组操纵，PCR 或将其他基因直接克隆到基因组中。将这些反向工程的基因组转染到合适的细胞培养系统中，该系统将复制基因组，产生组装所需的病毒蛋白并最终产生功能齐全的 IBV。重组 IBV 的大部分研究都是为了更好地理解病毒蛋白的功能并确定它们如何与宿主细胞相互作用。
结果表明去除重组 IBV 中的 S 基因用来自不同血清型 IBV的 S 基因替代可将病毒更改为该新血清型。新创建的重组 IBV 可用于诱导针对包含该 S 基因的病原性病毒的保护性免疫应答。该系统的优势在于与通过在胚蛋中传代而减毒所需的时间相比，通过重组技术可以相对较快地产生针对新近出现的变异型 IBV 的减毒活疫苗。重组 IBV 比其他可能的 IBV 具有多个优势成为候选疫苗。首先，重组 IBV 是能够感染的活病毒，其复制和产生的免疫反应与传统IBV 疫苗相同。由于病毒中所有蛋白质均存在，可以实现产生除 S 蛋白以外的其他免疫原性蛋白质。其次，随着进一步了解由 IBV 基因组编码的所有蛋白质的功能，可以开发新的重组IBV，经过修饰进一步致弱其致病性，而不是依靠持续的鸡胚适应。第三点也是最重要的，重组IBV 符合家禽疫苗的应用和成本。由于它们是活病毒，可以通过传统方法进行免疫，甚至在某些情况下通过卵内免疫接种。重组 IBV 产生后可以在胚卵中繁殖和维持。产生重组病毒的初始成本明显高于传统的胚胎传代方法，但这是一次性费用 。
3 展望
尽管养禽企业花费大量资金来控制 IB，但仍不断有报道涉及经典和新型病毒血清型 IB的暴发。IBV 基因型不断增加，以及缺乏交叉保护性免疫，增加了开发新型 IBV 疫苗的动力。虽然减毒活疫苗在该领域仍然较普遍，但是它们的修饰，例如通过反向遗传技术，将助于减少毒力返强的影响；病毒载体疫苗具有促进有效蛋白抗原产生并引起有效免疫应答的潜力，但是与减毒活疫苗一样，主要问题是母源抗体的中和作用与基于载体的疫苗的使用有关；
新一代疫苗如重组载体 DNA 疫苗，质粒 DNA疫苗和多表位疫苗可能会成为未来的主流疫苗，因为这些疫苗具有传递多种抗原的潜力，可产生广泛的抗体和细胞介导针对多种血清型的免疫应答。质粒 DNA 疫苗的使用通过预先存在的免疫力来规避中和作用，并通过不同的途径如黏膜和卵内途径递送，以及使用新颖的递送方法如纳米颗粒，可以增强它们的作用方式。1999 年英国的 Cook 教授提出了传染性支气管炎保护型概念；即“使用不同（血清型）的传染性支气管炎弱毒活疫苗免疫可拓宽呼吸道的保护谱，可抵抗不同血清型病毒攻毒”；目前已在全球各地养殖场使用并得到很好的印证 。
2013 年法国世界禽病大会论文集中广西大学莫美兰教授、韦平教授等也在其发表的论文中对中国的传染性支气管炎控制提到了“Ma5 和4/91,H120 和 4/91 的组合,对目前在现场流行的多数 IBV 变异株具稳定的保护效果”。未来的 IBV 疫苗必须针对不同的 IBV 血清型提供广泛的保护，符合国际安全法规，并且易于应用且具有成本效益，以被家禽业广泛接受。
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