细菌对药物的敏感试验
抗菌药物（包括中草药、抗菌素、磺胺类药物、呋喃类等）是兽医临床常用的药物。但是各种病原体对抗菌药物的敏感性各不相同，同时，由于抗菌药的广泛使用，以及广谱抗菌素的不断增加，它们不仅对病原体有一定的作用，而用在使用不当时常造成耐药性的出现，甚至于干扰机体内的正常微生物群的作用，反而对机体带来不良影响。因此，测定细菌对抗菌药物的敏感性，正确使用抗菌药物对于临床治疗具有重要的意义。Ⅰ 对抗菌药物的敏感试验
一、纸片法
纸片法操作简单，应用也最普遍。
（一）、抗菌素纸片的准备
1．将质量较好的滤纸用打孔机打成直径6mm的圆片，每100片放入一小瓶中，160度干热灭菌1—2h，或高压灭菌（68kg30min）后在60度条件下烘干。
2．抗菌药物的浓度
青霉素200U/ml 其它抗菌素1000微克/ml
磺胺类药物 10mg/ml 中草药制剂1g/ml
3．用无菌操作方法将欲测的抗菌药物溶液1ml，加入100片纸片中，置冰箱内浸泡1—2h，如立即试验可不烘干，若保存备用可用下法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存6个月）。
（1）培养皿烘干法 将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37度温箱内保持2—3h即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。
（2）真空抽干法将放有抗菌药物纸片的试管，放在干燥器中，用真空抽缺机抽干，一般需要18—24h。
4．将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用。并用标准敏感菌株做敏感性试验，记录抑菌圈的直径，若抑菌圈直径比原来的缩小，则表明该抗菌药物已失效。
（二）、培养基
一般细菌如肠道杆菌及葡萄球菌等可用普通琼脂平板；链球菌、巴氏杆菌或肺炎双球菌等可用血液琼脂平板；测定对磺胺类药物的敏感试验时，应使用无蛋白胨琼脂平板。
（三）、菌液
为培养10—18h的动物菌液（抑菌圈的大小受菌液浓度的影响较大，因而菌液培养时间一般不宜超过17h）。
（四）、试验方法
用铂金耳（或用镊子夹住消毒的棉球）取培养10—18h的幼龄菌，均匀涂抹于琼脂平板上，等干燥后，用镊子夹取各种抗菌素纸片，平均分布于琼脂表面（每个平板放置4—5片），在37度温箱内培养18h后观察结果。
（五）、结果判定
根据抗菌纸片周围无菌圈的大小，测定其抗药程度。因此，必须测量抑菌圈的直径（包括纸片），按其大小，报告该菌株对某种药物是敏感或是抗药（表1，表2，表3）。
表1青霉素抑菌圈的标准
抑菌圈直径 敏感性
<10mm 耐药
10—20mm 中度敏感
>20mm 敏感
表2 其它抗菌素及磺胺类药物的敏感标准
抑菌圈直径 敏感性
<10mm 耐药
11—15mm 中度敏药
>15mm 敏感
表3中药抑菌圈的标准
抑菌圈直径 敏感性
<15mm 耐药
15mm 中度敏感
15—20mm 敏感
二、试管法
试管法是将药物做倍比稀释，观察不同含量的药物对细菌的抑制能力，以判定细菌对药物的敏感度，常用于测定抗菌素及中草药对细菌的抑制能力。
（一）、试验方法
取无菌试管10支，排列于试管架上，于第一管中加入肉汤1.9ml，其余9管各加1ml。吸取配制好的抗菌素原液、磺胺类药液或中草药液0.1ml，加入第一管中，充分混合后吸出1ml移入第二管中，混合后，再由第二管移1ml到第三管，依次移到第九管，吸出1ml弃去。第十管不加药液作对照。然后向各管中加入幼龄菌稀释液0.05ml（培养18h的菌液作1：1000稀释，培养6h的作1：10稀释），于37度温箱中培养18—24h后观察结果。
（二）、结果判定
培养18h后，凡无细菌生长的药物最高稀释管中即为该菌对药物的敏感度（见表4）。若由于加入药物（如中药）而使培养基变为混浊，眼观不易判断时，可进行接种培养或涂片染色镜检判定结果。
表4 试管法药物敏感性试验浓度标准
药物名称 敏感（微克/ml） 中度敏感（微克/ml） 耐药（微克/ml）
磺胺类药 <50 50—1000 >1000
链霉素 <5 5—20 >20
青霉素 0.1 0.1—0.2 >2
多粘菌素、庆大霉素 <1 1—10 >10
金霉素、土霉素 1—110
四环素、红霉素、新
霉素、氯霉素、合霉素<2 2—6 >6
三、挖洞法
挖洞法适用于试验剂量较大的中草药煎剂、浸剂以及不易溶解的外用药物。
（一）、中药原液的制备
测定细菌对中药的敏感性时，通常采用水煎剂及粉剂两种。
1．中药水煎剂原液的配制法
通常配成1g/ml的溶液。其配制方法为，称取一定量的中药，磨碎，加5—10倍水（对质轻、体积较大的中药，水量可增加，以能淹没药物为止），煮沸1h，滤过，药渣内再加同量水，再煮沸1h，滤过，将两次药液混合，蒸发浓缩至每毫升相当于1g原生药浓度的原液。经3.6kg15min灭菌，放冰箱中备用。
2．中药试剂制备的注意事项
（1）未经炮制的中药材或新采集的中草药，必须首先洗净泥土，晒干，切碎，加工成粉末或煎剂供应用。
（2）称量要准确，制备煎剂或水浸剂时，浸泡的时间不宜过长，浓缩时加热火力不能过大，防止有效成分破坏或挥发，尤其是挥发性大的药物不宜火煎。
（二）、培养基的选择及菌液的准备
同纸片法。
（三）、试验方法
1．用铂金耳蘸取培养10—18h的幼龄菌少许，均匀地涂布于所用的平板培养基表面。
2．以直径8mm的金属在培养基上打洞，并于洞底加1滴熔化的灭菌琼脂，以密封洞底。
3．向洞内加入欲测的的药液，其加入量，煎剂为0.075ml，粉剂则加满。
4．放37度温箱中，培养24—48h后观察结果。
（四）、结果观察
同纸片法，见表5。
表5几种中草药敏感试验结果
药名金黄色葡绿脓溶血性 大肠
萄球菌 杆菌链球菌 杆菌
药名金黄色葡绿脓溶血性 大肠
球菌萄 杆菌链球菌 杆菌
乌梅 + + + + + + + + +
黄芩 + + + -
儿茶 + + 0
北沙参0 + +
地榆 + + + +
地骨皮 + + +
牡丹皮 + + + 0
五味子+ +
五倍子 + + + + + +
木瓜 + + + + + +
香薷 + + + -
石榴皮 + + + +
注：摘自《兽医实验诊断》，中国农业大学出版社，2000
四、快速敏感试验--葡萄糖指示法
许多细菌能分解葡萄糖而产酸，使培养基PH值发生改变。若在培养基中加入抗菌药物，接种的细菌对抗菌药物敏感时，细菌的发育繁殖被抑制，培养基中的葡萄糖就不能被细菌分解利用，不会形成酸性物质，PH值不发生变化，因而指示剂也不变色；相反，细菌对抗菌药物不敏感时，抗菌药物抑制不了该菌的的生长繁殖，因而分解葡萄糖并产酸，使加入其中的溴甲酚紫由紫变黄，以此来测定对药物的敏感性。具体操作方法如下：
1．抗菌素纸片及菌液的准备，同纸片法。
2．配制指示培养基：取普通琼脂15ml，加放1％葡萄糖及0.6％溴甲酚紫指示剂0.7ml。
3．灭菌后，待培养基凉至50度左右时，加入菌液0.5ml，充分混匀后（防止气泡产生），做倾注培养。
4．待凝固后，用镊子将抗菌素纸片分别贴于表面，于37度条件下培养24h观察。
5．结果判定：纸片周围有细菌生长者呈现黄色，不生长时仍为紫色，并测量抑菌圈的直径，判定其敏感度，方法同纸片法。
五、平板挖沟法
适用于中草药煎剂，或浸剂或试验不易溶解的药物。其操作方法如下：
（一）、试验材料
1．普通琼脂或血液琼脂培养基。
2．手术刀柄和刀片。
3．中草药原液（同挖洞法）。
4．被试细菌。
（二）、试验方法
1．用接种环（或灭菌的棉拭子）取被试菌的的10—18h肉汤培养物，均匀地涂布在琼脂平板上。
2．用灭菌刀片在琼脂平板上挖沟，沟宽6mm，长50mm。
3．将溶化的灭菌琼脂滴入沟内封底，以防药液渗漏。
4．将嵌条用的琼脂培养基加热溶解，凉至45—50度时加入一定量的中药粉，混匀后镶嵌于切去的琼脂条的平板槽内。
5．待冷却后，沿镶嵌条周围涂抹被测菌，培养于37度温箱内18—24h，然后观察结果。也可于切去琼脂后直接加入中药剂的方法观察细菌抑菌情况。观察结果时测其抑菌带的宽度。 学习 学习了 很全面,叙述详细,建议有实力的兽医门店都上一套 请问有没有复合药的药敏试验，几种药的交叉试验我感觉在临床上有时知道意义不是太大。
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