染色方法
㈠ 革兰氏染色一、目的： 在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
二、原理： 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现
缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
三、实验用品准备：
灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器
四、操作：
1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，
不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
6 媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
7 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
8 脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。
9复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
10 水洗： 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
11 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。 ㈡ 瑞氏染色
1原理：
瑞氏试剂中之酸性伊红和碱性美篮混合经化学作用后，变成中性之伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞核及浆中的NH3+和COO-等结合，使细胞核及胞浆着色。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆及其中之颗粒显色较为清楚。
2 试剂配制：
1瑞氏试剂
瑞氏染料（粉）1克，加不含醋酮之甲醇600毫升溶解过滤后即成。混合方式可将瑞氏染料置于研钵内，加适
量甲醇混合研磨，使染料溶解，将已溶解的液体倒入清洁玻瓶，再放入甲醇继续溶解剩下染料，直至染料及甲醇均用完为止，然后过滤，以深色中性之玻璃瓶储备待用。亦可将1克染料一次加入600毫升甲醇中，盛深色玻璃瓶内，塞好瓶口，置于温暖而黑暗之处或37度温箱内，每日振荡5min，连续7天以上，然后过滤储备用。染液宜久置后使用，通常存放愈久，染色效果愈好。
2、缓冲液： 由1%的磷酸氢二钠和1%的磷酸二氢钾各30毫升加蒸馏水1000毫升配成，或以上两药各1克加2500毫升左右蒸馏水制成。以石蕊试纸检验、调整酸碱度，使PH在6.5-7之间即可.缓冲液亦可永新鲜蒸馏水或煮沸后密闭保存的蒸馏水。如蒸馏水与空气过多接触，则可因吸收空气中之二氧化碳而使PH值变低，影响染色，故不宜使用。
3、染色步骤
1 将已编号之涂片水平置于染色板或者染色架上，涂片两端各划一道蜡笔线，主要防止染液外溢。
2滴加瑞氏染色液。其多少依标本所占面积大小而定，一般为4-8滴，至染液将标本完全盖住为止。染液不宜过少，否则，甲醛挥发后，易产生沉淀；不可过多，以免因过盛而流失，影响染色。
31-2分钟后，滴入缓冲液（染液与缓冲液的比例约为1：1.5，冬季1：1，夏季1：2）。以气囊向玻璃片上轻轻打气，使染液和缓冲液混合均匀，一般不宜口吹起，以免呼出二氧化碳改变缓冲液酸碱度而影响染色。
4自缓冲液滴入10-15分钟后，用自来水冲洗。冲洗时应将玻片持平，以流水滴入使染液及缓冲液自玻片边缘溢出，染料沉淀即随水浮去。冲洗时，切忌水力过大，以免将标本并染液同时冲走；冲洗前切不可先将染液倾去，否则沉淀将附于标本上不能除去，染色时间与染液的性质、酸碱度、气温等关系甚大，因此应灵活掌握。最好先冲洗一张，于低倍镜下初步检查，如细胞核浆分明，颗粒清楚，表示染色满意，此时，始可将其余涂片全部冲洗。如染色过浅，则需延长染色时间。
5冲洗、待干、镜检。如天冷或空气湿度大，可用吸水纸吸水
加快干燥速度。但切忌用力重压或擦拭，以免将标本中的细胞成分擦去或破坏。
4优缺点
其主要优点是染色方法简单、省时、易于推广，且染色较清晰，特别是胞浆及其中颗粒受染良好。根据我们的体会，在细胞学检查中，除个别情况外，瑞氏染色基本上可以解决绝大部分常见病的诊断问题。其不足之处是核染质及核膜的结构往往不如巴氏染色清楚。
5 染色不佳的原因及纠正方法
1 染色过深
A 表现：镜下细胞变小，核与浆均呈深蓝或蓝黑色、结构不清，红细胞呈碱性色。
B 原因
染色时间过长；染液过多或缓冲液过少；染液或缓冲液偏碱；夏季染色过程中甲醇挥发。
C 纠正
用甲醇脱色后重复染色。亦可用甲醇或瑞氏染液脱色数
秒后冲洗，再行镜检，脱色时间根据具体情况决定。
2 染色过浅
A表现：胞浆、浆内颗粒及核均不着色或着色过浅，红细胞亦不着色。
B原因：染色时间过短；染色液过少或缓冲液过多；染液或缓冲液偏酸
C 纠正
按原染色步骤重复染色。
3染色偏碱较常见
A 表现：红细胞呈蓝色或绿色，细胞核、细胞浆及颗粒染色深，结构不清。酸性颗粒亦蓝染，淋巴细胞呈灰色。
B 原因
基本与染色过深之原理相同，玻璃片偏碱、冲洗时间不足亦为可能之原因。
C 纠正
如染色过碱，可于其中加1%醋酸少许，或将涂片浸于95%酒精数秒中，然后冲洗。
4染色偏酸较少见
A 表现：镜下一片红色，胞核及嗜碱性颗粒亦红染或不着色。
B 原因
染料放置过久或与空气接触后甲醛氧化而成甲酸；玻片
或缓冲液偏酸。
C 纠正
新旧染液混合使用，借以调整其PH值，或于染液中加1%碳酸钠适量。
5沉渣过多；主要表现为涂片是那个大量颗粒状深染之渣滓。
A 原因：染液与缓冲液混合不均；冲洗前已将染液、缓冲液倾去；染色液未过滤；或天热干燥时，染液中甲醇挥发。
B 纠正
加甲醇使沉淀颗粒溶解，再行复染。
㈢吉姆萨染色法
1.材料
1g的姬姆色素染料加入66ml甘油，混匀，60度保温溶解两小时，再加入66ml甲醇混匀，即配成姬姆色素原液，此原液用前用PBS(6.8）稀释十倍左右就可以使用（此为姬姆萨工作液）。工作液可保存一个月左右，Camon固定（3体积乙醇+1体积冰乙酸）；
PBS缓冲液的配制：
母液的配制：
0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶与1000ml水
0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶与1000ml 水
各种浓度PBS(pH=7.4)的配制：
先配0.2M PBS (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4，81ml0.2mol/L的Na2HPO4,即可。
然后只需将0.2M PBS (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，
如：0.1M P B（PH=7.4）：取500ml 0.2M PBS，加水稀释至1000ml即可。
0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PBS，加水稀释至1000ml即可。
0.02M PB（PH=7.4）：取100ml 0.2 M PBS，加水稀释至1000ml 即可。
若需要NaCl的话，加入NaCl 至0.9%（g/100ml）即可。
3.方法
①涂片的制作与固定：用移液枪吸取10-20μL待检溶液滴在载玻片上,均匀涂布,室温下阴干后,用Camon固定液固定涂片10分钟。
②染色：置姬姆萨工作液30min。
③洗脱：染色完成后,涂片立即用ddH2O洗脱。
④显微镜观察：用甘油压片,指甲油封固。在100×油镜下观察。 多好的实用文章。怎么没人顶呢？
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