禽曲霉菌病诊断
禽曲霉菌病是多种禽类、哺乳动物和人畜共患的一种真菌病。主要侵害呼吸系统，在肺和气囊发生炎症和小结节，导致呼吸困难，甚至窒息死亡。病原体主要为曲霉属中的烟曲霉和黄曲霉，其次为构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉等。本病发生于世界各地，对雏鸡的危害最大，可引起幼雏大批死亡，造成重大经济损失。对曲霉菌病的诊断，近年来提出了一些新技术。但是，各国确定的常用方法，仍是病理学检查和病原学检查。病理学检查(包括在病变组织内发现曲霉菌)可以确定病性，病原学检查不仅可以提高诊断率，而且能够鉴定曲霉菌菌种。
（一）、病料采集对病理学检查可疑的病禽，应无菌操作采取带有病变(如结节、霉菌斑等)的组织各数小块，置于灭菌容器(如中试管)内冷藏，并尽快送检，如果不能立即送检，可暂时保存于30%甘油缓冲液中。
（二）、检验程序
1．镜检
（1）材料准备
①器材载玻片，盖玻片，培养皿，铂金耳或针，恒温箱，手术刀，普通显微镜等。
②试剂20%氢氧化钾溶液，乳酸酚棉蓝染色液，沙保劳(Sabouraud)氏葡萄糖琼脂培养基或改良察贝克(Czapek)氏琼脂培养基等，其配制方法附后。
（2）检查方法 压滴标本法。
取肺和气囊表面的结节置于载玻片上，加1～2滴乳酸酚棉蓝染色液或生理盐水，用大头针将组织块或菌团撕扯开，压上盖玻片(注意勿产生气泡)，制成压滴标本。如果组织碎块较硬，可改用1～2滴20%氢氧化钾溶液浸泡，并在火焰上微微加温后压片。显微镜检查时，先用低倍物镜发现目标，再用高倍物镜详细观察菌体形态。可见有树枝状的分隔菌丝和大量的分生孢子。经棉蓝染色的菌体呈蓝色。
2.分离培养法
（1） 沙保劳氏（或察氏）葡萄糖琼脂培养法 取培养皿若干个(通常每份样品用4个)，做好标记。将铂金耳在火焰上烧灼灭菌，冷却后钩取干酪样坏死组织或霉菌斑，均匀涂抹于培养基表面；或者用铂金针蘸取样品，小块点播刺种于培养基表层。接种完毕，放在24℃或37℃恒温箱内进行培养。通常于24h后可见在培养基有菌落出现，开始为白色，后逐步由中心向外变为绿色或青色，边缘仍为白色，菌落表面致密，菌丝呈棉絮状，（如右图）72h后呈暗绿色。
（2）马铃薯葡萄琼脂培养法无菌采气囊中的干酪样物浸入生理盐水中研碎，接种于马铃薯培养基上， 图烟曲霉菌培养物 白色绒毛样
37℃恒温箱内培养，24h可见长出粟粒大小、灰白色、圆形丝绒状菌落，48h后长成灰绿色大菌落。取结块锯屑或饲料1g，放入马铃薯葡萄琼脂培养基中于37度温箱中培养，24h长出灰白色菌落。
结果判定在可疑病禽(鸟)的病变组织中，观察到或分离出曲霉菌，即可确诊为禽曲菌病。如要确定为何种曲霉菌所感染，要依据菌落和菌体的形态特征，对所分离的曲霉菌进行菌种鉴定。
附
a.质量浓度为30%的甘油缓冲液
甘油(化学纯) 30.0mL
氯化纳(NaCl) 0.5g
磷酸氢二钠 1.0g
蒸馏水 加至100.0mL
先用少量蒸馏水溶解氯化钠和磷酸氢二钠，再加入甘油，最后用蒸馏水补足量，混合，分装，于103.6kPa灭菌15min～20min后保存备用。
b.乳酸酚棉蓝染色液
结晶石炭酸 20.00g
乳酸 20.00mL
甘油 40.00mL
棉蓝 0.05g
蒸馏水 20.00mL
将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入结晶石炭酸、乳酸、甘泊，混匀，备用。
c.沙保劳(Sabouraud)氏葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖 40 g
蛋白胨 10 g
琼脂粉 18g～20g
蒸馏水 1000mL
将以上成分倒入烧杯或三角烧瓶内，先加少量蒸馏水加热溶解。待完全溶解后补足蒸镏水至所需要的总体积，并加入氯霉素50μg/mL～100μg/mL，用四层纱布过滤，按要求定量分装于小烧瓶或中试管内，塞以棉塞，再于棉塞外加包牛皮纸和油纸各一层，挂上标签，于103.6kPa灭菌10min～15min后保存备用。
d.改良察贝克(Czapek)氏琼脂培养基
蔗糖 30.00g
硝酸纳 3.00g
磷酸二氢钾 1.00 g
硫酸镁 0.50g
氯化钾 0.50g
硫酸亚铁 0.0lg
氯化钠 60.00g
琼脂粉 18g～20.00g
蒸馏水 1000.00mL
3.禽曲霉菌病有关的曲霉菌的鉴别要点
（1）概述引起禽曲霉菌病的病原体主要为烟曲霉和黄曲霉，其次为构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉等，这些曲霉菌都具有如下共同的形态结构:
①菌丝:有隔，细胞多核；
②分生孢子梗:由特化的膨大而厚壁的菌丝细胞(即足细胞)的中部向上又生而成；
③顶囊: 分生孢子梗顶端的膨大部分，呈球形、椭球形、烧瓶形或棍棒形；
④小梗:被覆于顶囊周边，一层或两层。如为两层，则内层叫梗基，外层叫瓶梗；
⑤分生孢子:成串排列于小梗的游离端。
但是，不同的菌种在这些结构的形态上又有明显的不同。根据这些不同点，特别是分生抱子头(顶囊、小梗、分生孢子三部分的合称)的特征，结合菌落的形态和颜色，可将这几种曲霉菌区别开。
（2）鉴别要点
A．烟曲霉
菌落形态烟曲霉在沙保劳氏葡萄糖琼脂培养基上生长良好，发育很快。开始菌落呈白色绒毛样或棉花丝样，3d～4d内，菌落中心变为烟绿色或深绿色，表面微细粉末状或绒毛样(形成大量分生孢子之故)。菌落背面无色或略带黄褐色。
在察贝克氏培养基上，生长旺盛，菌落呈绒毛状，气生菌丝直立而丰富，分生孢子头初呈白色或微带蓝色，有呈绿色者，继而转变为黑褐色。菌落背面无色或呈黄色，老菌落则可呈暗红色。
菌体形态
①分生孢子梗:光滑，较短(300μm～500μm)，宽5μm～8μm，常带绿色；
②顶囊:烧瓶形，直径20μm～30μm，绿色；
③小梗:生于顶囊上部，单层，梗长6μm～8μm，梗粗2.5μm～3.0μm，排列紧密；
④分生孢子:球形或近球形，直径2.5μm～3.0μm，表面粗糙有细刺，带绿色；
⑤菌核:不产生。
B.黄曲霉
菌落形态菌落生长迅速，至10d～14d时，直径可达3cm～7cm。初似黄色粉末，继而密集隆起，变为黄绿色，日久则成棕绿色。表面平坦或有放射状沟纹。菌落背面无色或带褐色。
菌体形态
①分生孢子梗:长约400μm～1000μm，宽约10μm～20μm，微弯曲，梗壁极粗糙，近顶囊处略膨大，无色；
②顶囊:烧瓶形、球形或近球形，直径约10μm～65μm，但多数在25μm～45μm间；
③小梗:单层、双层或单层双层并存于一个顶囊上，但以双层者居多。梗基长约7μm～10μm，宽约4.0μm～5.5μm，布满顶囊表面。瓶梗长约6.5μm～10.0μm，宽约3μm～5μm；
④分生孢子:球形、近球形或梨形，直径约3.5μm～6.0μm，表面粗糙;
⑤菌核:有些菌系产生褐色菌核。
C.构巢曲霉
B.2.3.1菌落形态
在察贝克氏琼脂培养基上于27℃下培养，菌落生长快速，至14d时直径达5cm～6cm。最初为光滑绒毛状，亮绿色，平铺生长，继而变为暗绿色，中心呈粉末状，边缘有绒毛状菌丝。菌落背面深红色至紫红色。当闭囊壳形成时，菌落中心向外长出一些小白点，菌落呈黄褐色。
菌体形态
①分生孢子梗:极短(长约75μm～100μm，宽约3.5μm～5.0μm)，常有波状弯曲，近顶囊处稍膨大，壁光滑，带褐色或肉桂褐色；
②顶囊:半球形，直径8μm～10μm；
③小梗:双层，梗基短(长约5μm～6μm，宽约2μm)，分布于顶囊的顶部，呈放射状排列；瓶梗长约5μm～6μm，宽约2.0μm～2.5μm；
④分生孢子:球形，直径3.0μm～3.5μm，表面粗糙有小刺，绿色；
⑤闭囊壳:为该菌有性阶段的产物，球形，直径约135μm～150μm，略呈紫红色，内含子囊孢子。成熟的闭囊壳被淡黄色的壳细胞所包围。
D.黑曲霉
菌落形态在察贝克氏琼脂培养基上于25℃下培养，菌落扩展迅速，至10d～14d直径可达2.5cm～3.0cm。初期有丰富的白色羊毛状气生菌丝，并常出现鲜黄色区域，继而变成粗绒状，黑色、黑褐色。菌落背面无色，或仅中心部分略带黄褐色。
菌体形态
①分生孢子梗:长约200μm～400μm，也有长达1000μm以上者，宽约10μm～20μm，壁厚、光滑，无色或梗的上部稍带黄色；
②顶囊:球形或近球形，直径45μm～75μm，无色或带黄褐色;
③小梗:双层，紧密排列于整个顶囊表面，呈放射状，褐色。梗基约400～500个，每个梗基长约20μm～30μm，宽约5μm～6μm，有时更宽并具有横隔；瓶梗较短，长约7μm～10μm，宽约3.0μm～3.5μm；
④分生孢子:球形，直径4μm～5μm，褐色，表面极为粗糙;
⑤菌核:有些菌系产生菌核，从不定形到圆形，直径约1000μm。
E.土曲霉
菌落形态在察贝克氏琼脂培养基上生长较快，至10d时菌落直径达3.5cm～5.0cm。呈圆形，初平坦，或有放射状皱纹，渐而表面呈绒状，偶呈絮状，肉桂色或沙褐色。菌落背面培养基黄色或污褐色。
菌体形态
①分生孢子梗:长约100μm～250μm，宽约4.5μm～6.0μm，微弯曲，近顶囊处稍膨大，光滑，无色；
②顶囊:半球形，直径10μm～16μm；
③小梗:双层，梗基长约5μm～7μm，宽约2.0μm～2.5μm，平行密集于顶囊顶部；瓶梗长约5.5μm～7.5μm，宽1.5μm～2.0μm；
④分生孢子:球形或近球形，直径约2μm，表面光滑无棘；
④菌核:不产生。
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