鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定
摘要：无菌采取某鸡场送检的疑似大肠杆菌病的病死鸡的心血、肝、脾、肾，进行病原菌的分离、鉴定、生化试验，动物试验和药敏试验。结果显示引起该鸡场鸡只发病的病原为大肠杆菌，并且该菌对小白鼠和鸡有较强的致病力，对阿米卡星、链霉素、庆大霉素、氟苯尼考敏感，对环丙沙星、痢特灵中度敏感，对诺氟沙星不敏感，新诺明、红霉素、青霉素、氨苄西林、头孢唑啉钠则对其没有抑菌作用。表明该鸡场出现了耐药的致病性大肠杆菌，在以后的肉鸡生产中应慎用抗生素，在使用药物治疗大肠杆菌病时，应根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药。关键词：大肠杆菌；分离鉴定；致病性；药敏试验
大肠杆菌病是由大肠杆菌某些血清型菌株引起的一类疾病的总称。各个品种和日龄的鸡均可发病，但肉仔鸡最易感。该病一年四季均可发生，尤以冬季及夏季多发。在临床上可表现为败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、脐炎、关节炎、脑炎等，发病率高，死亡率高，且因与其他呼吸道疾病如慢性呼吸道病混合或并发感染而使死亡率升高。随着养禽业的迅速发展与高度集约化饲养，鸡大肠杆菌病已成为鸡群重要的疾病之一。为了控制鸡大肠杆菌在鸡群中的传播，我们对送检的疑似大肠杆菌病例进行病原的分离鉴定，并对分离菌的培养特性、致病力及抗菌药物的敏感性进行了研究，为有效防制鸡大肠杆菌病提供了依据。
1材料与方法
1.1 病料来源
2004年3月重庆市北碚区某鸡场送检的疑似大肠杆菌病的病、死鸡若干只，已死亡鸡只死亡时间不超过12 h。
1.2 细菌分离培养
无菌采集病、死鸡的肝脏、心血等组织，接种在普通琼脂平板及普通肉汤，37 ℃培养20 h，抹片，革兰氏染色后镜检。挑取表面光滑，边缘整齐，灰白色半透明的单个小菌落划线接种于麦康凯琼脂平板，于37 ℃培养20 h。
1.3 细菌形态学观察
取在麦康凯琼脂平板上培养20 h的新鲜菌落，抹片进行革兰氏染色镜检。
1.4 生化试验
糖发酵及生化反应按常规进行。
1.5 致病力测定
1.5.1 菌液制备 将分离菌接种于营养肉汤，于37 ℃培养20 h，4 ℃保存备用。
1.5.2 动物试验 购自第三军医大学动物研究中心小鼠10只，随机分为A1、B1两组，每组5只。A1组为试验组，B1组为对照组。A1组腹腔接种营养肉汤菌液，每只0.2 mL；B1组腹腔接种相同剂量的灭菌生理盐水，隔离饲养。
从市场购10日龄罗曼蛋鸡10只，饲养1周，临床健康。随机分为A2、B2两组，每组5只。A2组雏鸡颈部皮下接种0.2 mL营养肉汤菌液；B2组腹腔接种相同剂量的灭菌生理盐水，隔离饲养。
1.6 药敏试验
按K-B纸片扩散法将被检细菌涂布接种于普通琼脂平板上，间隔一定距离贴上各种药敏试纸，于37 ℃培养24 h，结果判断依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准（第四版）》进行。
2 结果
2.1 病鸡及病死鸡的病理剖检变化
病鸡肝脏肿大、质脆，有点状坏死灶，表面覆盖有黄白色的纤维素性渗出物；脾脏肿大，肺充血、淤血，部分鸡肺脏有1 mm～2 mm大小坏死灶；肾脏肿大，有尿酸盐沉积；十二指肠有出血性肠炎变化；盲肠扁桃体肿胀、出血。
2.2 细菌分离
在营养琼脂平板上37 ℃培养20 h后，形成中等大小，圆形微凸起，表面光滑湿润，浅灰色半透明菌落。在麦康凯琼脂平板上，形成中等大小，表面光滑湿润的粉红色菌落。
2.3 细菌形态学观察
病死鸡肝、肾等组织培养物涂片染色镜检，均可见两端钝圆，多数散在排列，偶尔有2个～3个连在一起的革兰氏阴性短杆菌。
2.4 生化试验结果
生化试验结果显示，此次分离的大肠杆菌对甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、蕈糖、果糖产酸产气，MR、棉子糖、山梨醇、鸟氨酸结果阳性，VP、卫矛醇、肌醇、硝酸盐、酒石酸盐、水杨素、精氨酸水解酶、侧金盏酰、DNA、阿拉伯醇、血清菊糖、鸟氨酸、
精氨酸脱羧酶、丙氨酸盐、ONPG、乙酰胺结果阴性，符合大肠杆菌的生化特征。
2.5 动物试验
2.5.1 肉汤中生长情况 分离菌在肉汤中培养18 h～24 h，呈均匀混浊，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌环。
2.5.2 致病性 A1组小鼠，4只24 h内死亡，1只36 h内死亡。剖检可见肝脏肿大，有出血点和坏死点；肠严重膨气，心包淤血，肺出血，脾脏淤血。采取A1组小鼠的心血、肝和脾接种在普通琼脂平板及普通肉汤，37 ℃培养20 h，有细菌生长。革兰氏染色及生化鉴定表明此菌与接种细菌为同种细菌。表明该菌对小鼠具有较强的致病力。B1组饲养7 d后全部存活，剖检未见病变。
A2组雏鸡3 d内全部死亡，剖检有与原发病鸡只相同的明显病变，雏鸡的心血、肝和脾均能回收到接种菌；B2组雏鸡全部健康存活，7 d后剖检未见有病变。
2.6 药敏试验
结果见表1。由表1可见，此次分离的大肠杆菌对阿米卡星、链霉素、庆大霉素、氟苯尼考敏感，对环丙沙星中度敏感，对诺氟沙星和痢特灵不敏感，而红霉素、青霉素、氨苄西林和头孢唑啉钠对分离菌完全没有抑制作用。新诺明的抑菌效果有待进一步证实，分离菌对其不敏感的一个可能原因是药物已接近其使用期限。
3 讨论
3.1 近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，在饲料添加剂及治疗中盲目使用一些抗菌药物，导致耐药菌株越来越多并日趋严重。而且大肠杆菌可通过菌毛将其抗药性质粒传递给其他大肠杆菌，所以大肠杆菌的抗药性形成较快，环境中大肠杆菌耐药性菌株越来越多。药敏试验结果可以看出，曾对大肠杆菌比较敏感的环丙沙星、诺氟沙星、痢特灵、头孢唑啉钠等随着不断的应用均产生了不同程度的抗药性。所以，在使用药物治疗大肠杆菌病时，有条件的应根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。
3.2 大肠杆菌是条件性致病菌，防制该病的关键在于加强饲养管理，做好各个环节的卫生消毒，消除各种发病诱因。日常要提供全价优质饲料，并足量补充维生素和电解质；夏季还要注意防暑；应添加饲料添加剂，如碳酸氢钠、杆菌肽锌、维生素C等；严格执行卫生防疫措施，创造一个良好的饲养环境。由于各地大肠杆菌的血清型，特别是优势血清型存在差异，有效而通用的菌苗尚未出现，因此筛选地区性免疫原性优良的大肠杆菌菌株制作菌苗，乃是防制鸡大肠杆菌免疫预防的基础。建议有条件的肉种鸡场，最好采用自家灭活苗，这样效果可靠，更适用于血清型复杂的地区 。 学习了
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