鹅巴氏杆菌病的病原分离鉴定及其病理学观察
摘 要：通过镜检、培养、琼扩试验、生化鉴定及动物回归等试验，从临床表现为神经症状、眼观主要病变为肝肿大、肝表面和切面有灰白色坏死灶为主要特征的病鹅体内分离出禽多杀性巴氏杆菌，其主要病理组织学变化为部分肝小叶内含有一个或多个凝固性坏死灶；大脑皮层血管周围有多量的中性粒细胞浸润，形成明显“血管套”现象，呈化脓性脑炎变化。通过电镜观察、SPF鸡胚接种和血凝抑制试验等排除了禽流感、新城疫等病毒感染的可能性，为禽巴氏杆菌病的诊断提供了资料。关键词：多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；病理学；鹅
巴氏杆菌病(Pasteurellosis)主要是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引起的畜禽共患的一种急性传染病。禽巴氏杆菌病(Avian pasteurellosis)又称禽霍乱(Fowl cholera)，是由多杀性巴氏杆菌禽型菌株引起禽类的一种急性、败血性、高度接触性传染病。本病对各种家禽包括鸡、鸭、鹅和火鸡都有易感性。近年来，随着养鹅数量的增加，交易频繁，鹅病的防控也逐渐引起养鹅场和兽医工作部门的重视。在危害养鹅业的传染病中，除小鹅瘟、禽流感和新城疫三大病毒性疾病外，危害较严重的细菌性疾病当属禽霍乱即鹅巴氏杆菌病。急性型鹅巴氏杆菌病传播迅速、发病急、死亡快，常造成巨大的经济损失。各地区关于鹅发生巴氏杆菌病的报道也屡见不鲜。
吉林省东辽县某大型鹅业有限公司，在外购种鹅过程中，发生以摇头等神经症状，肠道和实质器官出血、肝表面及切面呈灰白色坏死灶为主要特征的传染病，死亡率高达30%。本实验室从现场采集病料，进行病原分离鉴定并对典型病变组织进行了病理组织学观察，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源 吉林省东辽县鹅场的病死鹅。
1.1.2 病料处理 剖检病死鹅，记录眼观病理变化，并采取病死鹅心、肝、脾、肺、肾和脑等组织用100 mL/L中性甲醛固定；无菌操作采取病死鹅肝脏、脾脏和心血，做病料触片或涂片及细菌分离培养；病鹅翅下静脉采血10份，3 000 r/min离心5 min取其血清，做禽霍乱琼脂扩散试验、禽流感及新城疫HI实验；采取病死鹅脑、脾、粪样作电镜负染；无菌操作采取病死鹅的肝脏、脾脏研磨，用生理盐水制成悬液，接种SPF鸡胚。
1.1.3 药品与试剂 美蓝染液、革兰氏染液、琼脂糖、HE染液。血液琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血清肉汤、血清琼脂斜面培养基、半固体培养基、水解酪蛋白培养基及各类生化反应培养基和试剂等由本室保存；禽霍乱琼脂扩散抗原、阳性血清，购自中国兽药监察所；禽流感血球凝集抑制(HI)抗原H5、H7、H9；禽流感血球凝集抑制(HI)阳性血清H5、H7、H9购自哈尔滨兽医研究所；新城疫血球凝集抑制(HI)抗原和新城疫血球凝集抑制试验(HI)阳性血清，购自青岛易邦生物制品有限公司；标准菌株禽多杀性巴氏杆菌(5：A)，购自中国兽药监察所。
1.1.4 实验动物 健康小鼠16只，雌、雄各半，体重20 g～30 g，由吉林大学实验动物中心提供；SPF鸡胚(9日龄～11日龄)，由长春生物制品所提供。
1.2 方法
1.2.1 病理组织学观察 取新鲜组织块按常规方法制备病理组织切片，光镜下观察。
1.2.2 直接染色镜检 用病料触片，血液涂片，分别进行革兰氏染色和碱性美蓝染色，镜检。
1.2.3 细菌分离培养 将病料接种于血清肉汤中进行增菌培养，24 h后取肉汤培养物接种于血液琼脂平板、血清培养基、麦康凯培养基、半固体培养基上，在37 ℃培养18 h～24 h观察菌落特征，挑选典型菌落接种到斜面培养基上，保存，待鉴定。
1.2.4 生化培养 将接种肉汤培养18 h～20 h的各菌株菌液，移种于糖发酵培养基中，在37 ℃培养24 h～48 h，观察发酵情况。
1.2.5 致病力试验
1.2.5.1 动物接种 将分离到的菌种接种到血清肉汤培养24 h，用生理盐水作5倍稀释，取体重15 g～20 g小鼠12只分成2组，第1组6只，为试验组，每2只分别皮下接种菌液0.1、0.2、0.3 mL，观察发病情况；第2组6只，作为对照组，注射生理盐水。
1.2.5.2 病原再分离鉴定 对动物试验后分离到的菌株依据以上方法进行革兰氏染色、美蓝染色，镜检；进行培养性状观察，菌落荧光性检查，细菌运动性检查，生化鉴定等。
1.2.6 禽流感HA、HI试验 按常规方法进行。
1.2.7 新城疫HA、HI试验 按常规方法进行。
1.2.8 SPF鸡胚接种试验 无菌手术取病鹅的心、肝、脾组织，用生理盐水制成悬液，加0.02 g/L的头孢噻肟感作4 h灭菌后接种SPF鸡胚的尿囊腔内，接种后以熔化的石蜡将卵壳接种孔封闭，置于37 ℃恒温箱培养，上、下午各照蛋1次，24 h内死亡的鸡胚弃去，观察24 h以上死亡的鸡胚。
1.2.9 电镜观察 病料研磨处理后，以3 000 r/min离心5 min，取上清液，再以7 000 r/min离心10 min，上清液用0.2 mL/L磷钨酸负染，电镜下观察。
2 结果
2.1 病理学观察
2.1.1 眼观病理变化 病鹅表现摇头和头颈侧弯等神经症状(图1A)。鹅尸外观被毛蓬乱，口流黏液，鼻腔内也存有黏稠分泌物。肛门周围羽毛附有灰白色稀粪。剖检见鹅尸具有典型败血症变化，皮下组织淤血，胸部皮下肌肉呈条纹状出血。心包腔扩张，腔内蓄积较多量淡黄色液体(图1B)，心脏冠状脂肪沟与心外膜上可见大小不等的出血点及呈不同程度的出血性炎症变化；肺淤血、水肿；肝明显肿大，呈明显的淤血和实质变性变化(图1C)，表面和实质内散在有许多针尖大的白色或灰白色坏死灶(图1D)。脾脏淤血肿大，呈紫红色。肠道呈卡他性、出血性肠炎变化。
2.1.2 病理组织学变化 心肌纤维肿胀、断裂，心肌纤维间有多量炎性细胞和少量红细胞(图2A)；肝小叶失去固有结构，肝细胞发生颗粒变性和脂肪变性，部分肝小叶内散在一个或多个坏死灶，坏死灶内可见多量炎性细胞(图2B)；肾小管上皮细胞肿胀、脱落甚至堵塞管腔(图2C)，肾小管间毛细血管扩张，淤血、出血；肺淤血，部分肺泡呈代偿性肺气肿；大脑皮质神经元萎缩(图2D)；部分脑血管周围浸润多量的淋巴细胞和中性粒细胞，呈化脓性脑炎变化(图2E)；小肠绒毛脱落，覆有多量的黏液，呈卡他性肠炎变化。
A.病鹅表现摇头和头颈侧弯等神经症状；B.心包腔扩张，腔内蓄积较多量淡黄色液体；C.肝脏淤血；D.肝表面有针尖大小的灰白色坏死灶
A.Neural symptom of shaking head in sick geese；B.Cavitas pericardialis dilatation， in which pallide-flavens fluid accumulated；C.Congestion of goose liver；D.Gray needle tip size necrosis foci on the surface of liver
图1 病鹅临床症状及病理剖检变化
Fig.1 Clinical symptom and pathological anatomy changes of sick geese
A.心肌纤维肿胀、断裂、心肌纤维间有多量炎性细胞和少量红细胞(×20)；B.肝小叶内坏死区内可见多量炎性细胞(×10)；C.肾小管上皮细胞肿胀、脱落，堵塞管腔(×10)；D.大脑皮质神经细胞萎缩，细胞周围形成空腔(×20)；E.部分脑血管周围浸润多量的淋巴细胞和少量的中性粒细胞(×20)
A.Cardiac muscle fibers swell and rupture，inflammatory cells and erythrocytes distributebetween cardiac muscle fibers(×20)；B.Coagulationof inflammatory cells in necrosis foci ofhepatic lobules(×10)；C.Renal tubular epithelial cell swelling，sheddingand blockinglumens；D.Neuronal degeneration， hydropsia， vacuolated in cerebral cortex(×20)；E.Perivascular infiltration of lymphocytes and neutrophils，forming perivascular cuffing (×20)
图2 病鹅的病理组织学变化
Fig.2 Histopathological changes in sick geese
2.2 病料触片
肝脏触片在镜下可见到细小的球杆菌，两端钝圆，近似椭圆形，革兰氏阴性，美蓝染色两极浓染，具有荚膜，无芽胞，呈散在分布。
2.3 细菌培养特性
2.3.1 肉汤 37 ℃培养24 h后开始呈轻微混浊，混浊4 d～6 d后液体变清亮，于管底生成黏稠沉淀物，振摇后不分散，在培养液顶层形成菌环。
2.3.2 半固体培养基 37 ℃培养24 h后观察，细菌无运动性。
2.3.3 血液琼脂 37 ℃培养24 h后，培养基上有湿润、丰盛的水滴样小菌落，菌落周围无溶血现象。
2.3.4 血清琼脂 37 ℃培养24 h后，培养基上有淡灰白色、湿润、圆形，半透明的边缘整齐、表面光滑、闪光露珠状小菌落。
2.3.5 麦康凯培养基 不生长。
2.4 生化培养
将从病料中分离出的细菌进行生化鉴定，结果见表1。经生化特性鉴别，证明病料中分离出的细菌是多杀性巴氏杆菌。
表1 分离细菌的生化鉴定结果
Table 1 Identification of bacterial isolate in biochemistry
生化指标
Biochemical indicators
结果
Results
生化指标
Biochemical indicators
结果
Results
动力 Dynamia
－
乳糖 Lactose
－
靛基质实验 Indole assay
＋
鼠李糖 Rhamnose
－
胆汁 Bile
－
硫化氢 H2S
＋
葡萄糖 Glucose
＋
水扬苷 Salicin
－
甘露醇 Mannitol
＋
糊精 Dextrin
－
蔗糖 Sucrose
＋
卫矛醇 Dulcitol
＋
2.5 动物回归试验
第1组(试验组)小鼠在接种后2 h，精神沉郁，食欲废绝。8 h～48 h内6只小鼠先后死亡，剖检所见病理变化为呼吸道及消化道黏膜有出血点，脾不肿大，肝脏充血、肿大，其表面和实质内散布有针尖大小的灰白色或灰色坏死点。对照组无发病。
解剖小鼠后，取病变脏器染色镜检并同时进行细菌分离培养，其菌的特征与病料中分离的一致。在镜下可见革兰氏阴性球杆菌，美蓝染色呈两极着色的杆菌，血液培养基上培养24 h，见有表面光滑、边缘整齐，闪光的露珠状小菌落，不溶血，与鹅病料分离出巴氏杆菌一致。
2.6 禽流感HA和HI试验结果
待检血清全部为阴性。
2.7 新城疫HA和HI试验结果
待检血清全部为阴性。
2.8 SPF鸡胚接种
试验24 h后观察结果，至第7天，鸡胚发育状况良好，未见异常。
2.9 电镜观察
未发现病毒粒子。
3 讨论
一般来说，禽霍乱的诊断根据禽群发病情况，临床症状和病理变化，结合实验室诊断即可确诊。此次病鹅表现为发病急，发病率和病死率高；临床出现典型的“摇头”症状；经系统的病理学观察和病原的分离鉴定结合流行病学特征，确定引起该鹅场发生传染病的病原为禽多杀性巴氏杆菌。病理组织学观察结果显示，病鹅的主要病理变化在脑部，呈现典型的化脓性脑炎变化，这也是本次鹅群发病的症状以神经症状为主的原因。
由于受多种因素影响，近年来禽病的发生和流行已不再是呈现过去的单一病原性疾病，而往往表现为多病原，也有相当一部分是以非典型性疾病形式出现。目前，对养鹅业危害严重的传染病有小鹅瘟、禽流感和新城疫等病毒性疾病及巴氏杆菌等细菌性疾病。此次发病鹅的发病日龄、症状、病理变化与小鹅瘟不符，但因其发病率和病死率较高，出现神经症状，又未经疫苗免疫，不排除有其他病毒性疾病(如禽流感、新城疫等)感染的可能性。因此，进行
了实验室鉴别诊断，采集病料进行电镜负染，未发现病毒颗粒；SPF鸡胚接种未有病毒感染病变；且禽流感H5、H7和H9 3个血清型的HA和HI试验和新城疫病毒的HA和HI试验结果表明病鹅血清的禽流感及新城疫抗体呈阴性。基于以上试验结果，排除了禽流感和新城疫等病毒性疾病感染。
鹅巴氏杆菌病的病原是多杀性巴氏杆菌，该菌平时生存于鹅体的呼吸道和消化道内。鹅体健康时，细菌与鹅体保持平衡状态，不引起发病，当机体抵抗力降低或因外界环境条件改变时，这种平衡即被打破，细菌大量繁殖，疫病迅速流行。此次鹅群的发病率和病死率较高与气温变化、运输应激等因素有关。因此，提供和保持良好的环境条件，避免和减轻应激反应是预防疾病的基础性工作。做好此项工作需要提高饲养管理水平，提高饲养管理人员的防疫意识。其中包括实行饲养品种专一、全进全出制度、严格的卫生消毒管理、鹅舍保持适宜的温度和湿度、合理处理淘汰的病鹅和鹅尸等综合性措施。
随着集约化养禽业的迅速发展，“预防为主”防疫原则的重要性更加突出。在本次疫情中，原存栏鹅曾经免疫过禽霍乱，但出现了免疫失败，其原因是多方面的。排除疫苗、免疫程序和时间等多种影响因素外，推测本次发病的主要原因是引进鹅群不健康。因此，当从外地引进禽群时，要认真执行检疫和隔离制度，调查当地的疫病流行情况，必要时可通过各种实验室诊断手段，对引进鹅进行疫病检测，及时发现病鹅，并采取相应的处理措施。经检测后健康的鹅群也应隔离观察半个月，确认健康后，方可转入饲养禽舍。
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