禽流感病毒RT-PCR试验方法
1范围本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒H5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的RT-PCR鉴别技术。
本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 18936高致病性禽流感诊断技术
3实验室条件
3.1仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外凝胶成像仪、微量移液器、水浴箱等。
3.2从事RT-PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出RNA提取区、基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。
3.3注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧作无害化处理。
4试剂的准备
4.1试剂
4.1.1变性液：见附录A.1。
4.1.22M 醋酸钠溶液(pH4.0)：见附录A.2。
4.1.3水饱和酚（pH 4.0）。
4.1.4氯仿/异戊醇混合液：见附录A.3。
4.1.5M-MLV反转录酶（200u/μL）。
4.1.6RNA酶抑制剂(40u/μL)。
4.1.7Taq DNA聚合酶(5u/μL)。
4.1.81.0% 琼脂糖凝胶：见附录A.4。
4.1.950×TAE缓冲液：见附录A.5。
4.1.10溴化乙锭(10 μg/μL)：见附录A.6。
4.1.11加样缓冲液：见附录A.7。
4.1.12焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：见附录A.8。
4.1.135×反转录反应缓冲液（附录A.9）。
4.1.142.5mmol dNTPs（附录A.10）。
4.1.16DNA分子量标准。
4.2引物：见附录B。
5操作程序
5.1样品的采集和处理：按照GB/T 18936中提供方法进行。
5.2RNA的提取
5.2RNA的提取
5.2.1设立阳性、阴性样品对照。
5.2.2异硫氰酸胍一步法
5.2.2.1 将组织或细胞中加入适量的变性液，匀浆。
5.2.2.2将混合物移至一管中，按每毫升变性液中立即加入0.1mL乙酸钠，1mL酚，0.2ml氯仿-异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。
5.2.2.3将匀浆剧烈振荡10sec。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。
5.2.2.412 000 rpm，4℃离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。
5.2.2.5加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，并在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。
5.2.2.64℃ 12 000 rpm离心10 min，弃上清，再用75%的乙醇洗涤沉淀，然后离心，再用吸头彻底吸弃上清，在自然条件下干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水中。-20℃贮存，备用。
5.2.3或者选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取
5.3反转录
5.3.1取5μL RNA，加1μL反转录引物，70℃ 5min。
5.3.2冰浴2min
5.3.3继续加入：
5×反转录反应缓冲液 4μL
0.1M DTT 2μL
2.5mmol dNTPs 2μL
M-MLV反转录酶 0.5μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
DEPC水 11μL
37℃水浴1h，合成cDNA链。取出后可以直接进行PCR，或者放于-20℃保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。
5.4PCR
根据扩增目的不同，选择不同的上/下游引物，M-229U/M-229L是型特异性引物，用于扩增禽流感病毒的M基因片段；H5-380U/H5-380L、H7-501U/H7-501L、H9-732U/H9-732L分别特异性扩增H5、H7、H9亚型血凝素基因片段；N1-358U/N1-358L、N2-377U/N2-377L分别特异性扩增N1、N2亚型神经氨酸酶基因片段
PCR为50μL体系，包括：
双蒸灭菌水 37.5μL
反转录产物 4μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
10×PCR Buffer 5μL
2.5mmol dNTPs 2μL
Taq酶 0.5μL
首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入1滴液体石蜡(约20μL)。循环参数为95℃5 min，94℃ 45 sec，52℃ 45 sec，72℃ 45 sec，循环30次，72℃延伸6 min结束。设立阳性对照和阴性对照
5.5电泳
5.5.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.4。
5.5.2取5 μL PCR产物与0.5µL加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。
5.5.3加入分子量标准
5.5.4盖好电泳仪，插好电极，5V/cm电压电泳，30-40min
5.5.5在手提紫外线灯下观察；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档，打印
5.5.6用分子量标准比较判断PCR片段大小
6结果判定
6.1在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带时判定结果。
6.2用M-229U/M-229L检测，出现大小为229bp扩增片段时，判定为禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.3用H5-380U/H5-380L检测，出现大小为380bp扩增片段时，判定为H5血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.4用H7-501U/H7-501L检测，出现大小为501bp扩增片段时，判定为H7血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.5用H9-732U/H9-732L检测，出现大小为732bp扩增片段时，判定为H9血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。
6.6用N1-358U/N1-358L检测，出现大小为358bp扩增片段时，判定为N1神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性
6.7用N2-377U/N2-377L检测，出现大小为377bp扩增片段时，判定为N2神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性 一。关键看引物。可以说这是目前进行PCR的一个难点。
二。还要注意研究根据转录或反转录的链长提供给每个反应阶段一个合适的温度和变性延伸时间
三。电泳出来的条带是很模糊，要跑的好必须有足够的实验经验。
四。目前荧光PCR用的还是效果好，操作简单一些。
五。这项技术投资可能就是5万块钱吧。但对诊断病有很大的研究，可惜了解这个的人很少，希望不久能实现这个愿望。 对这个项目有研究的朋友加QQ79924163
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